一天两篇Nature！值得了解的铁死亡靶点筛选思路

作为2012年首次提出的一种新型细胞死亡方式[1]，铁死亡一经发现就引起了广泛关注，在神经退行性疾病、脑卒中、癌症等诸多研究领域中都有其身影。探究铁死亡的调控机制，以此寻找新的疾病治疗靶点，成为了当今的研究热点之一。CRISPR文库作为靶点筛选的有力工具，早已在铁死亡研究领域大放异彩。今天，小源就为大家梳理一下CRISPR文库是如何应用到铁死亡靶点筛选的研究中吧！

01

铁死亡发生机制

小源给大家先简单介绍一下铁死亡是如何发生的吧，顾名思义，铁死亡是一种铁离子依赖的细胞死亡方式，当细胞外的三价铁离子Fe3+ 通过转铁蛋白被转运到细胞质中，Fe3+ 会被还原形成亚铁离子Fe2+ ；在正常情况下，Fe 2+ 会优先形成Fe2+ 复合物，多余的Fe2+ 则通过亚铁转运蛋白运输到细胞外。当Fe2+ 含量超负荷后，过量的Fe2+ 无法及时排出细胞，并且在细胞质中大量聚集，游离的Fe2+ 进一步通过芬顿反应产生大量的活性氧(ROS)物质，这些ROS则会造成细胞膜上不饱和脂肪酸过氧化，使得细胞膜功能丧失以及细胞膜破裂，最终导致细胞死亡[2-4]。

图1 铁死亡调控信号通路[4]

本质上，铁死亡的发生是由于细胞内氧化还原系统失衡、过氧化物含量过高，使得细胞膜上的不饱和脂肪酸被氧化，造成细胞膜功能受损甚至破裂。谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)由于其高效的膜脂过氧化物清除能力，是首个被发现的铁死亡抑制剂且被认为是铁死亡的核心调控因子。随着铁死亡研究的发展，尤其是CRISPR文库筛选技术的产生，越来越多的铁死亡调控因子被发现，其中大家所熟知的FSP1、GCH1以及最新报导的DHCR7等基因均是通过CRISPR文库筛选发现，接下来小源为大家一一介绍吧。

02

CRISPR文库筛选发现FSP1

在一些GPX4敲除的肿瘤细胞系中，一些细胞仍然具有铁死亡抗性，这意味着除了GPX4以外，还有其他通路调节铁死亡。为了找出其他的铁死亡抗性基因，Bersuker等人对骨肉瘤细胞 U2 OS进行了合成致死文库的筛选。使用GPX4抑制剂RSL3处理U2 OS文库细胞后，通过负向筛选发现FSP1显著丢失，说明FSP1基因敲除对铁死亡高度敏感即FSP1的表达会抑制细胞铁死亡的发生。研究者们进一步实验发现，FSP1通过产生抗氧化形态的CoQ10促进癌细胞对铁死亡的抵抗作用[5]。随着铁死亡研究的深入，越来越多的FSP1与铁死亡相关的文章被发表，这些文章的发表证明了CRISPR文库筛选靶点的可靠性。

图2 合成致死文库筛选发现FSP1[5]

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03

GCH1/BH4信号通路抑制铁死亡

除了上述提到的FSP1/CoQ10信号通路抑制铁死亡，GCH1/BH4也是近年来通过CRISPR文库筛选发现的抑制铁死亡的信号通路之一。Kraft等人使用三种不同铁死亡诱导方式（RSL3、IKE和GPX4基因敲除）处理小鼠成纤维细胞，并进行全基因组激活文库筛选。通过比较分析三种不同处理方式中sgRNA富集信息，研究者们发现只有GCH1基因在这三种处理条件下均显著富集。该团队进一步研究发现，GCH1通过促进抗氧化剂BH4的表达从而抑制细胞铁死亡[6]。无独有偶，Soula等人用代谢基因敲除文库筛选Jurkat细胞中的铁死亡抗性基因，同样发现GCH1基因以及其他BH4合成相关的基因显著富集，并验证了在Jurkat细胞中GCH1/BH4信号通路对铁死亡的抑制作用[7]。

图3 全基因组激活文库[6](图A)与代谢基因敲除文库[7](图B)均富集到GCH1

04

7-DHC含量调控铁死亡

最近，同济大学王平教授团队于Nature杂志上发表了一篇通过全基因组敲除文库筛选铁死亡靶点的文章。该团队使用RSL3处理293T文库细胞后，通过测序分析发现远端胆固醇合成通路基因显著富集，其中MSMO1、CYP51A1、EBP和SC5D基因具有抗铁死亡的作用，而DHCR7具有促进铁死亡的作用。在远端胆固醇合成通路中，MSMO1、CYP51A1、EBP和SC5D基因促进7-脱氢胆固醇（7-DHC）的合成，而DHCR7则会促进7-DHC转变为胆固醇，这说明7-DHC含量可能是调控铁死亡的关键。进一步研究7-DHC与铁死亡之间的关系，该团队发现7-DHC在铁死亡中充当抗氧化剂的作用，以自身被氧化为代价抑制磷脂过氧化，从而避免铁死亡的发生[8]。值得一提的是，Freitas等人在Nature上同期发表的背靠背文章也指出7-DHC是内源性的铁死亡抑制剂，这也印证了文库筛选结果的准确性[9]。

图4 全基因组敲除文库筛选揭示远端胆固醇合成通路与铁死亡的关系[8]

其实，使用CRISPR文库筛选到的铁死亡靶点远不止于此，如姜学军团队通过全基因组激活文库筛选发现MBOAT2基因调节细胞中不饱和脂肪酸成分，抑制铁死亡发生[10]；Ryan等人使用全基因组敲除文库筛选神经细胞，发现囊泡运输基因SEC24B促进小胶质细胞铁死亡[11]等等。

通过以上案例不难看出，用CRISPR文库筛选靶点具有精度高、可重复性好等特点，并且CRISPR文库已助力多篇铁死亡研究高分文章发表。而目前发现的铁死亡靶点基因可能只是铁死亡调控网络中的冰山一角，在不同细胞中可能有其独特的铁死亡调控机制，所以还有很多铁死亡未知靶点等待发掘。如果你有寻找铁死亡靶点的需求，赶紧将CRISPR文库用起来吧！

参考文献

[1]Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, Patel DN, Bauer AJ, Cantley AM, Yang WS, Morrison B 3rd, Stockwell BR. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012 May 25;149(5):1060-72.

[2]Bai Q, Liu J, Wang G. Ferroptosis, a Regulated Neuronal Cell Death Type After Intracerebral Hemorrhage. Front Cell Neurosci. 2020 Nov 16;14:591874.

[3]Stockwell BR. Ferroptosis turns 10: Emerging mechanisms, physiological functions, and therapeutic applications. Cell. 2022 Jul 7;185(14):2401-2421.

[4]Tang D, Chen X, Kang R, Kroemer G. Ferroptosis: molecular mechanisms and health implications. Cell Res. 2021 Feb;31(2):107-125.

[5]Bersuker K, Hendricks JM, Li Z, Magtanong L, Ford B, Tang PH, Roberts MA, Tong B, Maimone TJ, Zoncu R, Bassik MC, Nomura DK, Dixon SJ, Olzmann JA. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 2019 Nov;575(7784):688-692.

[6]Kraft VAN, Bezjian CT, Pfeiffer S, Ringelstetter L, Müller C, Zandkarimi F, Merl-Pham J, Bao X, Anastasov N, Kössl J, Brandner S, Daniels JD, Schmitt-Kopplin P, Hauck SM, Stockwell BR, Hadian K, Schick JA. GTP Cyclohydrolase 1/Tetrahydrobiopterin Counteract Ferroptosis through Lipid Remodeling. ACS Cent Sci. 2020 Jan 22;6(1):41-53.

[7]Soula M, Weber RA, Zilka O, Alwaseem H, La K, Yen F, Molina H, Garcia-Bermudez J, Pratt DA, Birsoy K. Metabolic determinants of cancer cell sensitivity to canonical ferroptosis inducers. Nat Chem Biol. 2020 Dec;16(12):1351-1360.

[8]Li Y, Ran Q, Duan Q, Jin J, Wang Y, Yu L, Wang C, Zhu Z, Chen X, Weng L, Li Z, Wang J, Wu Q, Wang H, Tian H, Song S, Shan Z, Zhai Q, Qin H, Chen S, Fang L, Yin H, Zhou H, Jiang X, Wang P. 7-Dehydrocholesterol dictates ferroptosis sensitivity. Nature. 2024 Feb;626(7998):411-418.

[9]Freitas FP, Alborzinia H, Dos Santos AF, Nepachalovich P, Pedrera L, Zilka O, Inague A, Klein C, Aroua N, Kaushal K, Kast B, Lorenz SM, Kunz V, Nehring H, Xavier da Silva TN, Chen Z, Atici S, Doll SG, Schaefer EL, Ekpo I, Schmitz W, Horling A, Imming P, Miyamoto S, Wehman AM, Genaro-Mattos TC, Mirnics K, Kumar L, Klein-Seetharaman J, Meierjohann S, Weigand I, Kroiss M, Bornkamm GW, Gomes F, Netto LES, Sathian MB, Konrad DB, Covey DF, Michalke B, Bommert K, Bargou RC, Garcia-Saez A, Pratt DA, Fedorova M, Trumpp A, Conrad M, Friedmann Angeli JP. 7-Dehydrocholesterol is an endogenous suppressor of ferroptosis. Nature. 2024 Feb;626(7998):401-410.

[10]Liang D, Feng Y, Zandkarimi F, Wang H, Zhang Z, Kim J, Cai Y, Gu W, Stockwell BR, Jiang X. Ferroptosis surveillance independent of GPX4 and differentially regulated by sex hormones. Cell. 2023 Jun 22;186(13):2748-2764.e22.

[11]Ryan SK, Zelic M, Han Y, Teeple E, Chen L, Sadeghi M, Shankara S, Guo L, Li C, Pontarelli F, Jensen EH, Comer AL, Kumar D, Zhang M, Gans J, Zhang B, Proto JD, Saleh J, Dodge JC, Savova V, Rajpal D, Ofengeim D, Hammond TR. Microglia ferroptosis is regulated by SEC24B and contributes to neurodegeneration. Nat Neurosci. 2023 Jan;26(1):12-26.

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