细胞外microRNA-92a通过调节血管平滑肌细胞表型变化促进动脉硬化

动脉硬化被认为是高血压的并发症和各种心血管疾病的合并症。临床上，动脉硬化可以通过测量臂踝脉搏波传导速度（PWV）进行非侵入性评估。功能失调的内皮在血管僵硬的病理学中起主要作用。血管平滑肌细胞（VSMC）的可塑性，其特点是从收缩表型到增殖表型的去分化转变，也有助于动脉硬化。然而，血管内皮细胞（ECs）和VSMCs之间的生理通讯是血管稳态的组成部分。

MicroRNAs（miRNA）是小型的非编码RNAs。越来越多的证据表明，细胞外miRNAs可以作为心血管疾病诊断、治疗和预后的生物标志物。心血管系统中miR-92a水平升高与心血管疾病的病理生理学有关。循环miR-92a水平与高血压的临床标志物如24小时动态血压参数、颈动脉内膜-中膜厚度和颈动脉-股动脉PWV相关，因此，miR-92a在高血压的发病机制中具有重要作用。

之前研究表明，增加的miR-92a水平通过靶向Krüppel样因子2（KLF2）、KLF4和sirtuin 1（SIRT1）等基因导致EC功能障碍，这些基因对稳态内皮细胞至关重要。EC miR-92a可通过细胞外囊泡（EVs）转运至巨噬细胞，以下调KLF4水平。然而，尚不清楚高血压发作期间ECs中失调的miR-92a水平是否会导致动脉硬化，如果是，其潜在机制是否涉及通过miR-92a进行EC-VSMC通讯。

因此，西安交通大学第一附属医院心血管内科、西北大学生命科学与医学部、美国加州大学医学院心脏病学系的一项联合研究曾探索了miR-92a在EC-VSMC串扰中的作用及其对动脉硬化的相应影响。结果揭示了人类和小鼠循环的miR-92a水平与PWV之间的负相关。潜在机制涉及ECs中增加的miR-92a水平，调节VSMC可塑性。锁定核酸-修饰的反义miR-92a（LNA-miR-92a）改善了血管紧张素II（Ang II）诱导的小鼠高血压，这表明miR-92a拮抗剂在改善动脉硬化方面具有治疗潜力。

高血压患者血清miR-92a水平升高

首先，实验设置了高血压患者组和健康对照组。从血液中分离血清并测量miR-92a的水平。结果表明，与健康对照组相比，高血压患者表现出显著更高的循环miR-92a水平（图1 A）。

为了研究miR-92a的循环水平是否与动脉硬化相关，实验比较了两组的PWV，一种评估动脉僵硬度的指标。结果表明，高血压患者的PWV高于对照组（图1 B）。高血压患者的血清NO水平显著低于对照组（图1 C），但血清内皮素-1（ET-1）水平较高（图1 D）。血清miR-92a水平与收缩压和舒张压（SBP和DBP）、臂踝PWV（baPWV）和血清ET-1水平呈正相关（图1 E-H），但与血清NO水平呈负相关（图1 I）。此外，baPWV与血清NO水平呈负相关，但与血清ET-1水平呈正相关（图1 J、K）。这些结果表明，循环中的miR-92a水平提示高血压发作期间的内皮功能障碍和动脉硬化。

图1 高血压患者的血清 miR-92a 水平升高。

（A）对高血压（HTN）和健康对照组（HC）患者血清miR-92a水平的qPCR分析。（B）患者和对照组的臂踝脉搏波速度（baPWV）。（C、D）血清NO和ET-1水平。（E-I）血清miR-92a水平与baPWV（E）、SBP（F）、DBP（G）、血清ET-1（H）和NO（I）之间的相关性。（J、K）baPWV与血清NO（J）和ET-1（K）水平的相关性。

Ang II诱导miR-92a和EC功能障碍

高血压发作期间升高的Ang II水平对心血管系统具有不利作用。因此，实验检查了ECs中的miR-92a是否可以被Ang II诱导。Ang II处理后以剂量和时间依赖性方式增加ECs中miR-92a的水平（图2 A、B）。对ECs稳态至关重要的基因，包括eNOS、KLF2和KLF4，都是miR-92a的靶点。Ang II处理降低了ECs中eNOS、KLF2和KLF4的mRNA和蛋白质水平（图2 C、D），但促炎和纤维化ET-1的表达增加（图2 C、D）。这些结果表明，Ang II诱导的EC功能障碍可能是由升高的miR-92a水平介导的。

图2 Ang II诱导 miR-92a 和 EC 功能障碍。

（A）用不同浓度的Ang II处理24 h的HUVECs中miR-92a水平的miRNA qPCR分析。（B）用Ang II（200 nM）处理不同时间HUVECs中miR-92a的相对水平。（C、D）用Ang II（200 nM）或PBS（Ctrl）处理HUVECs 24 h，分别用qPCR和蛋白质印迹法测定KLF2、KLF4、eNOS和ET-1的蛋白质水平。

miR-92a调节VSMCs的表型变化

因为VSMCs的收缩到合成表型变化会导致动脉硬化，因此实验探讨了ECs中增加的miR-92a水平是否会影响VSMC表型。

在与VSMCs共培养之前，HUVECs用Ang II或PBS处理24小时（图3 A）。在用Ang II处理的ECs和从Ang II处理的ECs的条件培养基中分离的EVs中，miR-92a的水平升高（图3 B、C）。此外，与磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理的ECs相比，与Ang II处理的ECs共培养的VSMCs中的miR-92a水平升高（图3 D）。

然后测量了与收缩和增殖表型相关基因的mRNA水平。在与Ang II处理的ECs共培养的VSMCs中，收缩标志物（α-SMA、smoothelin和smoothelin）的mRNA水平降低，但增殖标志物（纤连蛋白、骨桥蛋白和血小板反应蛋白）的mRNA水平增加（图3 E）。

鉴于miR-92a水平在颈动脉内膜损伤后显著增加，实验分析了来自颈动脉的RNA-seq数据（GSE164050）。与上述结果一致，VSMCs收缩表型的标记基因下调，而增殖表型的标记基因上调（图3F）。

接下来研究了由Ang II刺激的EC衍生的EVs是导致VSMCs收缩到合成表型变化的原因。在与VSMCs共培养的EC之前，将HUVECs与Ang II和20 μM GW4869孵育24小时以阻断或不阻断EVs的形成。如图3G-I，GW4869处理减轻了VSMCs的收缩到合成表型的变化。实验用从Ang II处理的ECs的条件培养基中分离出来的EVs进一步处理naïve VSMC（图3J）。在EVs孵育下，ECs和VSMCs中miR-92a的水平增加（图3K、L）。此外，在与EC衍生的EVs孵育的VSMCs中，纤连蛋白、骨桥蛋白和血小板反应蛋白的mRNA水平增加，但α-SMA、smoothelin和calponin的mRNA的水平降低（图3 M）。

总的来说，结果表明，Ang II诱导的ECs中的miR-92a水平可以通过EVs转移到相邻的VSMCs，这导致VSMCs的收缩到合成表型的变化。

图3 miR-92a调节VSMCs的表型变化。

（A）在静态共培养系统中，在与VSMCs共培养之前，用200 nM Ang II或PBS（Ctrl）处理HUVECs 24 h。（B-D）HUVECs（B）、EVs（C）和VSMCs（D）中miR-92a水平的qPCR分析。（E）与Ang II或PBS处理的HUVECs共培养的VSMCs中收缩基因和增殖基因的相对表达。（F）热图显示根据内膜损伤（N1-4）和对照组（C1-4）颈动脉中的Z评分的差异表达基因的表达。（G–I）与200 nM Ang II孵育24小时后，将20μM GW4869与HUVECs共培养24小时。EVs（G）和HASMCs（H）中的相对miR-92a水平。指示基因在HASMCs中三组的相对表达（I）。（J）用Ang II或PBS处理的HUVECs的条件培养基的EV处理Naïve VSMCs 24小时。（K、L）HUVECs和VSMCs中miR-92a mRNA水平的qPCR分析。（M）用Ang II或Ctrl组EC衍生EVs处理的VSMCs中指示基因的相对表达。

LNA-miR-92a降低高血压易感性

为了进一步阐明miR-92a在该小鼠模型中VSMCs表型转变中的作用，实验评估了小鼠主动脉中与收缩与增殖表型相关的转录本。与LNA-Ctrl给药相比，LNA-miR-92a给药显著降低了主动脉ECs和SMCs中Ang II升高的miR-92a水平。在接受Ang II和LNA-miR-92a的小鼠的主动脉中，α-SMA、smoothelin、calponin的mRNA水平降低，而纤连蛋白、骨桥蛋白和血小板反应蛋白的mRNA水平升高。因此，外源性施药LNA-miR-92a可有效减轻与Ang II诱导的小鼠高血压相关的动脉僵硬度。

为了证明CD144+-EVs中的miR-92a对体内VSMCs的表型变化至关重要，实验还从用Ang II或盐水处理的小鼠中分离出血清CD144+-EVs，然后将这些EVs注射到野生型小鼠中。结果表明，从Ang II处理的小鼠分离的CD144+-EVs的小鼠的血清和VSMC miR-92a水平显著增加。一致地，接受这些CD144+-EVs的小鼠的VSMC收缩标志物显著降低，而增殖标志物增加。

这些数据表明，CD144+-EVs与miR-92a相关，至少在一定程度上有助于Ang II给药小鼠的血管功能障碍和VSMC表型转变。

图4 EC miR-92a在Ang II刺激下调节VSMCs可塑性的示意图。

Ang II诱导的EC功能障碍可导致EC-miR-92a通过EVs转移到邻近的VSMCs，以调节VSMCs的收缩至增殖表型变化，从而导致动脉硬化。

动脉硬化被认为是高血压的并发症，由血压升高的长期不良反应以及其他危险因素引起。反过来，血管僵硬是高血压的病理性罪魁祸首。在分子水平上，动脉僵硬受到VSMC张力和EC信号传导的影响，这些信号传导是由衰老、血管生长因子、钙化以及先天性和适应性免疫的激活引起的。在这项研究中，发现功能失调的ECs和VSMCs之间的串扰可以促进动脉硬化。具体而言，细胞外miR-92a丰度升高从受损的ECs运输到VSMCs，从而促进血管僵硬。

参考文献：Wang C, Wu H, Xing Y, Ye Y, He F, Yin Q, Li Y, Shang F, Shyy JY, Yuan ZY. Endothelial-derived extracellular microRNA-92a promotes arterial stiffness by regulating phenotype changes of vascular smooth muscle cells. Sci Rep. 2022 Jan 10;12(1):344. doi: 10.1038/s41598-021-04341-1. PMID: 35013491; PMCID: PMC8748448.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35013491/

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