中科院1区-遵义医大&西南医大: 肠道菌和代谢组学揭示黄芩苷对衰老过程中牙槽骨炎性吸收的保护作用

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导读

随着人口老龄化和预期寿命的延长，牙周炎和牙缺失已成为主要的健康问题。肠道微生物群作为骨稳态的关键调节因子，引起了人们的极大兴趣。黄芩苷是从黄芩中提取的黄酮类化合物，具有抗氧化和抗炎活性。本研究首次探讨了黄芩苷通过调节肠道菌群和代谢产物以及肠道屏障功能改善衰老小鼠牙槽骨炎性吸收的机制。我们在D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老小鼠中建立结扎诱导的牙周炎模型，并以不同剂量给予黄芩苷13周。我们每周测量体重；采用血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平评价黄芩苷的抗氧化和抗炎活性；通过胸腺和脾脏指数评估免疫能力；在心脏、肝脏、回肠和牙周组织中观察到组织病理学变化；检测上颌第二磨牙的牙槽骨吸收，并通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数破骨细胞；此外，我们使用16S rRNA测序和非靶向代谢组学分析粪便样本，以确定肠道细菌组成和代谢产物的差异。黄芩苷具有抗衰老特性，与对照组相比，血清中SOD活性增加，MDA、IL-6和TNF-α水平降低。黄芩苷还可改善D-半乳糖诱导的衰老性牙周炎组的牙槽骨丢失（p<0.05）。此外，黄芩苷通过上调ZO-1和occludin在衰老牙周炎组的表达来恢复回肠通透性（p<0.05）。α多样性分析表明，黄芩苷处理的小鼠肠道微生物具有更高的多样性。PCoA和ANOSIM结果显示各组之间存在显著差异。黄芩苷可恢复牙周炎小鼠中厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）的比例，该比例在牙周炎小鼠中降低。此外，中剂量黄芩苷促进了有益黄酮类化合物的产生，并富集了短链脂肪酸（SCFAs）产生菌。肠道稳态是治疗与年龄相关的牙槽骨丢失的潜在途径。黄芩苷通过调节肠道微生物群和代谢产物发挥抗炎、抗氧化和骨保护作用。

论文ID

原名：Integrated microbiome and metabolomics revealed the protective effect of baicalin on alveolar bone inflammatory resorption in aging

译名：综合微生物组学和代谢组学研究显示黄芩苷对衰老过程中牙槽骨炎性吸收的保护作用

期刊：Phytomedicine

IF：7.9

发表时间：2023.12

通讯作者：王倩& 汪新宇

通讯作者单位：遵义医科大学，西南医科大学

实验设计

实验结果

1.黄芩苷对小鼠具有抗衰老作用

六组之间的初始体重没有显著差异（表S1，p>0.05）。从第10周开始，衰老牙周炎小鼠（D+Lig+Veh）的体重缓慢增加（图1A）。而在14周结束时，D+Lig+Veh的小鼠体重显著低于其他小鼠（图1A，表S1，p<0.05）。与非衰老小鼠（sham+Lig+Veh）相比，D-gal干预导致衰老牙周炎小鼠发生各种变化。我们发现，D+Lig+Veh小鼠的SOD活性较低，MDA水平较高，血清中IL-6和TNF-α水平升高，脾脏和胸腺指数显著降低（图1B～D，p<0.05）。衰老小鼠肝细胞排列紊乱，细胞质疏松空泡化，心肌细胞间距增大（图S1）。

黄芩苷给药后，衰老-牙周炎给药高剂量黄芩苷（D+Lig+M/Hbai）组的体重、SOD活性和免疫器官指数呈上升趋势，MDA含量、血清IL-6和TNF-α浓度呈下降趋势（图1，表S1，p<0.05）。黄芩苷中、高剂量组在抗衰老过程中无明显差异。

图1 不同剂量黄芩苷给药对D-gal诱导的衰老-牙周炎小鼠体重（A，体重趋势）、氧化应激水平（B，血清SOD和MDA含量）、全身炎症负荷（C，血清IL-6和TNF-α含量）和免疫器官指数（D，胸腺和脾脏指数）的有益影响。统计显著性用方框图顶部的不同字母表示（p<0.05）。

2. 黄芩苷对衰老牙周炎小鼠牙槽骨丢失的改善作用

结扎位置导致牙槽骨严重破坏。衰老牙周炎小鼠（D+Lig+Veh）的牙槽骨损失明显多于D+Ph+Veh和D+Lig+L/M/Hbai（L/M/Hbai表示低/中/高剂量黄芩苷）组（图2A～B）。其龈沟上皮发生网状增生，有大量炎症细胞，伴有交界上皮向顶部迁移，并有牙槽嵴高度下降（图S2）。与牙周健康小鼠相比，牙周炎小鼠中也出现更高数量的破骨细胞（D+Ph+Veh，图2C～D）。黄芩苷显著改善了衰老牙周炎小鼠的龈沟内上皮网状增生和牙槽骨吸收，并有效恢复了牙槽嵴的高度，中剂量和高剂量黄芩苷处理组的破骨细胞数量显著减少（图2）。虽然中剂量和高剂量黄芩苷对牙槽骨的保护作用没有显著差异，我们仍观察到中剂量黄芩苷对牙槽骨具有更大的保护作用。

图2 黄芩苷可显著改善衰老牙周炎小鼠的牙槽骨吸收（A～B）和破骨细胞（C～D）。统计显著性用方框图顶部的不同字母表示（p<0.05）。

3.黄芩苷对衰老牙周炎小鼠肠道微生态的调节作用

在患有D-半乳糖诱导的衰老和牙周炎的小鼠中，我们发现回肠中ZO-1和occludin蛋白的表达水平显著降低（图3）。中剂量和高剂量黄芩苷导致肠上皮中ZO-1和occludin的表达水平显著上调，并恢复回肠通透性，这通常伴随着肠道微生物群的改变。

图3 黄芩苷可恢复衰老牙周炎小鼠的肠上皮屏障功能。回肠中Occludin（A～B）和ZO-1（C～D）的免疫组织化学染色和平均染色强度。统计显著性用方框图顶部的不同字母表示（p<0.05）。

我们采用16S rRNA扩增子测序的V4区域来评估黄芩苷对衰老牙周炎小鼠肠道微生物群组成的影响，从三组（D+Lig+Veh、D+Ph+Veh和D+Lig+Mbai）的粪便样本中总共检测到1824个OTU。维恩图显示，D+Lig+Veh、D+Ph+Veh和D+Lig+Mbai组中分别有1028个共享OTU和208、79和206个独特OTU（图S3A）。

α多样性的ACE和Chao1指数显示，牙周炎显著降低了衰老牙周炎小鼠的肠道微生物群丰度，而Shannon指数显示黄芩苷显著增加了肠道微生物群的多样性（图4A～D）。基于Bray-Curtis距离的PCoA和进一步的ANOSIM分析揭示了各组之间的显著差异（图4E～F，图S3B）。

我们在检查门水平上排名前35位的细菌的相对丰度时，还注意到肠道微生物群总体组成的差异（图4G）。厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比率是一种与肠道健康相关的常见微生物标志物，在牙周炎小鼠中降低（D+Lig+Veh:4.4502±0.1046，D+Ph+Veh:0.5305±0.1406）。黄芩苷部分恢复了F/B比率（0.5170±0.09177），但差异无统计学意义（p>0.05）。

图4 16S rRNA测序揭示了衰老/衰老牙周炎小鼠与黄芩苷处理之间肠道微生物群的变化。（A～D）α多样性ACE、Shannon、Simpson和Chao1指数。数据表示为平均值±标准偏差（SD）。统计显著性采用T检验进行评估。（E）基于Bray-Curtis相异性进行主坐标分析，以探索D+Lig+Veh（n=10）、D+Ph+Veh（n=9）和D+Lig+Mbai（n=10）的肠道微生物群特征。（F）使用ANOSIM分析比较三组之间肠道微生物群组成的相似性和差异性。R>0表示组间差异大于组内差异。统计分析的可靠性用p值表示。（G）在门水平上，三组中前35个差异富集的肠道微生物群的热图。（H）LEfSe分析表明，D+Lig+Veh和D+Lig+Mbai组的肠道细菌显著富集。显示LDA得分>3的Taxa。

我们进行LEfSe分析以确定各组之间差异丰富的判别OTU（图4H，S4）。结合MetaStat结果（表S2～S3），我们发现黄芩苷干预后有六种OTU显著不同，包括Anaeroplasma、GCA-900066575、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae UCG-001、Prevotellaceae UCG-001和一种未鉴定的细菌。

Spearman检验用于评估前35种高丰度细菌（属水平）与衰老、肠道屏障完整性和牙槽骨损失相关指标之间的相关性。与来自LEfSe和MetaStat结果的显著不同的细菌进行整合，我们发现拟杆菌、Acinetobacter、乳杆菌、阿克曼菌、Leuconostoc、Rikenella和Pseudonocardia与牙槽骨吸收和破骨细胞计数呈正相关（p<0.05），而Lachnospiaceae UCG-001和GCA-900066575表现出统计学上显著的负相关（p<0.05）（图5）。同时，最后两个肠道菌属与肠道屏障完整性和SOD水平呈正相关。肠内关键菌Lachnoclostridium与SOD和脾脏指数呈正相关，但与MDA和IL-6水平呈负相关。

图5 前35种肠道微生物（属水平）与衰老、牙周炎和肠道屏障相关参数之间的Spearman相关系数热图。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

4. 黄芩苷主要改变衰老牙周炎小鼠粪便代谢产物

我们进行了非靶向代谢组学分析，以进一步发现在100mg/kg的中剂量下黄芩苷影响的潜在代谢产物和途径。与微生物群组成相似，根据PCA和PLS-DA结果（图6A～B），不同组的粪便样本在很大程度上是分开的，这表明它们之间的代谢特征不同。

黄芩苷对衰老牙周炎小鼠的52种不同代谢产物产生了影响，如火山图所示（图6C，表S4），其中40种代谢产物上调，12种代谢产物下调。有17种差异代谢物无法在现有数据库中进行注释，其余主要富集在苯丙素类和聚酮类化合物中（n=12，23.08%），其次是脂质和类脂分子（n=10，19.23%），以及有机酸和衍生物（n=9，17.31%）（图6D）。此外，我们在衰老和衰老牙周炎小鼠中鉴定出24种显著差异的代谢产物（图S5A，表S5），其中18种代谢产物上调，6种代谢产物下调。这些差异代谢产物主要富集在脂质和类脂分子中（45.00%），其次是苯丙素类和聚酮类（20.00%）、有机酸及其衍生物（15.00%）和类苯类（15.000%）（图S5C）。此外，热图中显示了差异代谢特征的全局概览（图6E，S5C）。

图6 肠道代谢组学特征的差异。三组之间粪便代谢物谱的PCA（A）和PLS-DA（B）评分图。（C）火山图显示了D+Lig+Veh和D+Lig+Mbai小鼠之间52种不同累积的[log2（FoldChange）在x轴上]和显著改变的[-log10（p值）在y轴上]代谢物。（D）与黄芩苷相关的不同粪便代谢产物类别的比例。（E）D+Lig+Veh和D+Lig+Mbai之间显著不同代谢物的热图。（F）KEGG途径富集散点图显示了黄芩苷处理后粪便代谢过程的变化。

近一半的代谢物无法通过KEGG进行注释，这限制了我们对其特定功能的理解。黄芩苷处理后，我们发现显著富集的途径是类黄酮生物合成和异黄酮生物合成（图6F）。另一方面，牙周状况主要影响类固醇激素的生物合成途径（图S5D）。

为了研究肠道微生物组的改变与代谢产物的积累之间的可能联系，我们使用Pearson的相关方法检验了每种模式中前15个差异富集的肠道微生物属与前20个差异表达的代谢物之间的相关性。黄芩苷处理上调了多种黄酮类化合物，如白杨素、汉黄芩素、染料木黄酮、乔松素、非瑟酮和儿茶酸，与Prevotellaceae UCG-001、Lachnoclostridium、Anaeroplasma、Lachnospiraceae UCG-001，阿克曼菌、Dubosiella、LachnospiraceaeUCG-006、Enterorhabdus、A2和Rikenellaceae RC9 gut group的丰度呈正相关。相反，在这些黄酮类化合物与Mucispirillum的丰度之间呈负相关。黄芩苷还改善了衰老牙周炎小鼠的胆汁酸和氨基酸代谢，这与Prevotellaceae UCG-001、Mucispirillum、GCA-900066575、阿克曼菌和Lachnoclostridium表现出强烈的相关性（图7）。例如，Lachnospiraceae UCG-001与IL-6浓度、破骨细胞数量和牙槽骨吸收呈负相关，而与粪便代谢产物如染料木黄酮和非瑟酮呈正相关。与D+Lig+Veh和D+Ph+Veh相比，次级胆汁酸生物合成与阿克曼菌、Weissella、乳杆菌、Leuconoctoc和未鉴定的Clostridia vadinBB60 group呈正相关。类固醇激素的变化与乳杆菌呈显著负相关，同时与Anaerotruncus、Enterorhabdus和Faecalibaceterium呈正相关（图S6）。

图7 前15个差异富集肠道菌属的丰度与前33个差异代谢产物（左侧为13个负离子模式的代谢产物，右侧为20个正离子模式的代谢物）的Pearson相关系数。相关效应由从红色（负相关）到蓝色（正相关）的颜色梯度表示。*/**/***，表示相关性具有统计学意义，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

据我们所知，这项研究提供了初步证据，证明黄芩苷对衰老相关牙周炎的保护作用。这些作用的机制涉及肠道微生物组成和代谢产物的调节。我们的研究结果表明，补充黄芩苷丰富了产生短链脂肪酸（SCFA）的细菌，增加了粪便中胆汁酸、类黄酮和衍生物的水平，减轻了氧化损伤和炎症，并恢复了肠道屏障的完整性。因此，黄芩苷可改善衰老牙周炎小鼠的牙槽骨损失。

牙周炎的进展以牙槽骨吸收为特征。为了解决这一问题，牙周炎的治疗干预措施旨在抑制破骨细胞的形成和骨吸收。黄芩苷是黄芩中含量最丰富的天然黄酮苷，可通过抗炎、抗氧化、免疫调节等多种药物作用，在牙周治疗中发挥作用。在本研究中，黄芩苷给药显著降低了血清中炎症因子IL-6和TNF-α的水平，增加了衰老牙周炎小鼠的胸腺和脾脏指数（图1），并改善了在牙周组织中观察到的病理变化（图2）。这种改善可能归因于破骨细胞的减少，这最终改善了牙槽骨的炎性吸收。

年龄相关的肠屏障功能障碍与回肠中紧密连接蛋白如ZO-1和occludin的表达减少有关。此外，结扎诱导的SD大鼠牙周炎可降低肠上皮中ZO-1和occludin的水平。这会导致肠道菌群失衡，并加剧全身慢性炎症。在这项研究中，我们发现黄芩苷干预有效上调了肠上皮中ZO-1和occludin的表达，从而恢复了回肠的通透性（图3）。

本研究重申了牙周炎对肠道微生物群和粪便代谢产物变化的影响。牙周炎通常会导致肠道微生物群α多样性的降低，而α多样性是疾病相关微生态失调的可靠标志。与衰老小鼠（D+Ph+Veh；图4A～B）相比，我们在衰老牙周炎小鼠（D+Lig+Veh）的粪便微生物组成中观察到显著更高的ACE和Chao1指数。我们推测，这种差异可能归因于老年人口腔细菌通过血行和肠内途径向肠道的转化率较高。在门水平上，衰老的牙周炎小鼠增加了Actinobacteriota、Synergistota、Actinobacteria、Myxococcota、疣微菌和酸杆菌门的丰度（表S1）。前两个门是常见的口腔微生物，这表明牙周炎相关的变化可能会影响老年小鼠肠道细菌的多样性。此外，厚壁菌门和拟杆菌门是主要的肠道细菌，专门发酵膳食纤维并产生短链脂肪酸（SCFAs），如丁酸、丙酸和乙酸，对宿主代谢有各种影响。骨密度低的老年人通常具有明显较低的F/B比率。这项研究显示了类似的情况：在接受牙槽骨吸收的老年小鼠中，F/B比率倾向于降低。黄芩苷处理后，衰老牙周炎小鼠肠道菌群多样性和F/B比值增加。此外，已鉴定的六种生物标志物OTU中有四种是SCFA产生菌属（图4H）。考虑到Anaeroplasma是提高lgA水平的有效抗炎益生菌的最有潜力者，我们发现黄芩苷增加了衰老牙周炎小鼠中Anaeroplasma的丰度，这与较高的胸腺指数显著相关（图5）。GCA-900066575和Lachnospiraceae UCG-001细菌都属于毛螺菌科，已知其成员是丁酸盐的有效生产者。丁酸盐是一种SCFA，具有广泛的药理特性，包括调节微生物组、抗炎作用、抗肥胖活性、调节代谢途径、抑制血管生成和抗氧化作用，这可能归因于其增强肠道屏障完整性的能力。在本研究中，黄芩苷增加了衰老相关牙周炎小鼠中这两个丁酸产生属的丰度，其中GCA-900066575与SOD活性的增加显著相关，Lachnospiraceae UCG-001丰度的增加与IL-6浓度、牙槽骨吸收和破骨细胞数量的减少显著相关（图5）。此外，PrevotellaceaeUCG-001和拟普雷沃氏菌属是产生SCFAs的细菌，可改善宿主代谢紊乱。例如，Prevotellaceae UCG-001可以识别肠上皮细胞上的GPR41/43，激活AMPK信号通路，随后改变下游代谢功能。黄芩苷增加了衰老牙周炎小鼠中Prevotellaceae UCG-001的丰度，并与MDA浓度的降低显著相关。拟普雷沃氏菌在衰老的牙周炎小鼠中更为丰富，与其他异常骨病如克汀病（一种地方性退行性骨软骨病）一致。黄芩苷降低了衰老牙周炎小鼠拟普雷沃氏菌的丰度，并显著伴随着更高的最终体重、SOD含量和脾脏指数。此外，嗜黏蛋白阿克曼菌（属于疣菌门阿克曼菌属）是一种在免疫调节和改善代谢紊乱方面有前景的益生菌。黄芩苷增加了阿克曼菌的丰度，这与胸腺指数的改善呈正相关。最新发表的研究强调了口腔微生物群改变在牙周炎治疗中的重要性。例如，在结扎诱导的牙周炎（LIP）小鼠模型中，电针刺（EA）治疗可以显著减轻牙周骨吸收，抑制巨噬细胞的浸润，并调节牙周微生物组的组成。在临床治疗严重牙周炎的过程中，与传统治疗相比，全口使用赤藓糖醇喷砂粉似乎会导致牙周微生物群落向更好的状态转变。虽然本研究未检测到黄芩苷对口腔微生物群的影响，但推测随着牙周状况的改善，口腔微生态必然会发生变化。

除了对口腔健康产生局部影响外，牙周炎还与许多系统性疾病的发病机制和进展密切相关，包括心血管系统、内分泌系统和消化系统疾病等。牙周病原体的移位，以及相应的炎症反应和炎症因子的释放，被认为是牙周炎和各种系统性疾病之间相互作用的机制。为了进一步评估肠道微生物组变化对宿主的影响，我们进行了粪便代谢组分析，以回答“它们在做什么？”的问题。衰老小鼠牙周炎诱导的差异代谢产物主要影响类固醇激素生物合成途径（图S5D）。高水平类固醇激素对牙周病的调节可能是由于激素会增加病原微生物的生长或改变血管特性。

黄芩苷与肠道微生物群表现出双向相互作用，因为它不仅调节肠道微生物群的组成，还调节代谢，从而产生有助于对抗衰老和牙周炎的生物活性代谢产物。黄芩苷是黄芩素在不同动物模型和人类给药后释放的主要代谢产物。口服时，黄芩苷通过肠道细菌的β-葡萄糖醛酸酶的作用水解为黄芩素。此外，黄芩素随后在肠道中通过尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶的活性转化回黄芩苷。黄芩苷给药主要影响类黄酮生物合成途径。肠道微生物群介导的代谢过程富集了10种黄酮类化合物和异黄酮类化合物，这些化合物具有广泛的药理活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌特性（图6D～F，表S4）。其中，花旗松素已被发现通过调节肠道微生物群组成和增加SCFAs的产生来缓解DSS诱导的结肠炎。儿茶素在减轻牙周炎组的炎症和牙槽骨损失方面表现出显著的有效性。它的治疗潜力扩展到肥胖、结肠癌以及其他癌症等疾病，这归因于它能够抑制致病菌，同时促进健康相关细菌维持肠道稳态。黄芩苷还引起了有机酸和衍生物的显著变化，其特征是上调S-磺基-L-半胱氨酸、天冬酰胺、甘氨酸-L-亮氨酸、ILK、GLK和ALK，以及下调L-焦谷氨酸和N-乙酰-L-酪氨酸。半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及谷胱甘肽代谢主要受到影响。氨基酸是宿主代谢功能和状态的宝贵指标，对维持氮平衡、碳水化合物或脂质的转化、酶和激素的合成以及某些维生素的组成有重要贡献。例如，口服天冬酰胺有效地恢复了创伤性结肠损伤大鼠的肠道稳态并延长了创伤后生存时间。

图8 黄芩苷对老年人牙槽骨的骨保护作用示意图。这些作用是通过调节氧化应激、炎症、肠道屏障功能、肠道微生物群和代谢产物介导的。

结论

在这项研究中，我们对D-半乳糖诱导的衰老伴随牙周炎小鼠给予不同剂量的黄芩苷处理，发现可显著改善衰老和牙周炎症状，如血清炎症指数和氧化应激的减轻，以及牙槽骨和肠道屏障损伤的减轻。黄芩苷通过提高SCFAs产生菌和黄酮类化合物的丰度而显示出强大的保护作用。代谢组学生物标志物，如白杨素、乔松素、汉黄芩素、染料木黄酮、牛磺脱氧胆酸钠盐和N-P-coumaroyl spermidine，通过中等剂量的黄芩苷上调，并富集了以Lachnospiraceae UCG-001、Butyricicoccus、拟普雷沃氏菌、GCA-900066575、Lachnosspiraceae UCG-006和阿克曼氏菌为代表的多种健康相关肠道细菌属。这些发现表明，黄芩苷通过增加肠道微生物群的多样性和丰富次生代谢产物，特别是黄酮类化合物的产生，以其抗炎、抗氧化和免疫调节特性，对衰老的牙周炎小鼠发挥了潜在保护作用（图8）。

原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711323005925?via%3Dihub

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