农科院首次实现利用CO₂自养生物合成异亮氨酸、缬氨酸

随着工业的快速发展，全球 CO₂ 排放量再创新高。过量的 CO₂ 排放加剧了温室效应和极端天气事件，包括台风、暴雨和干旱等。

近年来，人们提出了许多生物化学、电化学和生物方法来回收 CO₂。如利用 CO₂ 合成无细胞淀粉；通过还原 CO₂ 先后实现了丝氨酸的电催化合成和甘氨酸的化学酶合成；自养微生物通过代谢工程将 CO₂ 转化为高价值的生物资源......

近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所张杰团队在Bioresource Technology期刊发表论文，工程化改造Cupriavidus necator用于异养和自养合成 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸，这两种氨基酸广泛应用于食品、饲料和医药行业。在以葡萄糖为底物的异养发酵中，L-异亮氨酸和 L-缬氨酸滴度分别达到 857 和 972 mg/L；在以 CO₂ 作为碳源的自养发酵中，滴度分别达到 105 和 319 mg/L。

这项研究首次实现了利用 CO₂ 自养生物合成L-异亮氨酸和 L-缬氨酸，为开发C. necator作为微生物工厂以利用 CO₂ 生产氨基酸提供了可行的解决方案。

（来源：上述论文）

自 2019 年以来，张杰主要从事利用合成生物学技术进行畜牧业用生物活性物质高效生产的研究工作。以大肠杆菌、毕赤酵母等为出发菌株，通过基因工程、代谢工程、进化工程等，优化微生物细胞代谢网络，打通从基因组到产品的技术链条，提高畜牧业用生物活性物质的产率与效率，构建高效微生物细胞工厂。

自养微生物可以通过代谢工程将 CO₂ 转化为高价值的生物资源。Cupriavidus necatorH16 是一种化能自养革兰氏阴性细菌，也被称为聚羟基丁酸酯（PHB）自然合成的模式生物。通过完整的卡尔文循环，C. necator 能够利用 CO₂ 作为单独碳源进行自养生长。相关研究此前不少，如合成糖类、醇类等，最近的研究首次实现了 C. necator 在自养发酵中利用水果废物生产 1.7 g/L 的 PHB。

α-酮丁酸是经典异亮氨酸生物合成中的重要中间体。α-酮丁酸的生物合成涉及 8 个酶促反应，以丙酮酸为前体。柠檬苹果酸合成酶（ cimA编码）、异丙基苹果酸异构酶（IPMI）和异丙基苹果酸脱氢酶（IPMD）的表达能够将 α-酮丁酸的合成简化为 3 个反应。经简化后的反应可更高效生成 α-酮丁酸。因此，推测简化的异亮氨酸合成途径可能具有更大的催化特异性和更简单的代谢调控网络。

对于缬氨酸生物合成，乙酰羟酸合酶（AHAS）首先通过催化两个丙酮酸转化为乙酰乳酸，将碳流引导至缬氨酸合成。接下来的催化过程遵循与异亮氨酸相同的原理。

使用丙酮酸和乙酰辅酶 A 作为前体，C. necator合成 PHB 作为能量储存物质，在不平衡的营养条件下可以积累高达细胞干重的 90%。PHB 合成途径中大量的丙酮酸和乙酰辅酶 A 通量为异亮氨酸（通过柠檬酸途径）和缬氨酸的生物合成提供了重要保证。

因此，本研究旨在构建C. necator中基于丙酮酸和乙酰辅酶 A 的 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸生物合成途径，从而实现自养发酵中 CO₂ 向这两种支链氨基酸的生物转化。

▲图 | A 经典异亮氨酸的合成途径；B 本研究中所使用的经过简化的异亮氨酸合成途径（来源：上述论文）

首先，为了提高电穿孔效率，研究人员敲除C. necatorH16 的 H16_A0006 基因，获得菌株 Cn101。

尽管拥有完整的葡萄糖分解代谢途径，野生型C. necator由于缺乏葡萄糖转运系统而无法利用葡萄糖。目前报道了两种策略来解决这个问题：1）引入来自运动发酵单胞菌的 glf 基因；2) NagE 与 Gly256Arg 的错义突变以及 nagR 的破坏。

本研究采用了两种方法，分别生成菌株 Cn103（glf 过表达）和 Cn104（ΔnagR、nagEG793C）。菌株 Cn102（携带 pBBR1-MCS2 的 Cn101）用作对照。结果发现，使用葡萄糖作为单独碳源时，菌株 Cn104 生长得更快。因此，选择 Cn104 构建氨基酸生产菌株。

在此前的报道中，已经证实柠檬酸途径成功应用于合成异亮氨酸。为了证实该途径在C. necator中生产异亮氨酸的可行性，研究人员敲除 Cn101 的 ilvA 基因，并将含有 cimA3.7 基因的质粒转化到菌株中，获得菌株 Cn107。在 cimA3.7 的质粒表达下，Cn107 在 80 mg/L 异亮氨酸的条件下生长得更好，并表现出与 Cn101 相似的生长特性。这些发现表明，柠檬酸途径是 C. necator 中异亮氨酸合成的高效途径。

根据上述结果，将 cimA3.7 基因整合到 Cn104 的基因组中，并由强天然启动子 PphaC1 驱动。继续将编码来自大肠杆菌的 BCAA 输出蛋白的 ygaZH 基因与 PphaC1 连接并整合到基因组后，得到的菌株 CnIle2 的培养基中检测到 56 mg/L 的异亮氨酸。

足够的前体对于提高代谢工程的生产效率至关重要。敲除 PHB 合成途径将为目标产物的合成提供更多的碳源，因此编码 PHB 合成的关键酶（phaC1AB1 操纵子）获得菌株 CnIle4 ，目标产物异亮氨酸的效价明显增加至 113 mg/L ；继续过表达 cimA3.7 基因后，异亮氨酸滴度曾至 248 mg/L。

在补充碳源和氮源，并优化微量元素的比例后，异亮氨酸滴度增加到 363 mg/L。在表达 AHAIR（编码乙酰羟酸异构还原酶）和 ilvE （编码支链转氨酶）、cimA3.7-pBBR1 后，异亮氨酸滴度增加到 483 mg/L，且发酵液中未检测到乳酸、乙酸或中间体丙酮酸等副产物。

在构建缬氨酸生产菌株时，研究人员首先过表达了 ygaZH 和 ilvD，并敲除了 phaC1AB1 操纵子，且整合了 PECPS-pBBR1，缬氨酸滴度达到 113 mg/L；ilvBH 基因的表达能够使缬氨酸滴度增加到 621 mg/L。

为了进一步探讨异亮氨酸和缬氨酸生产菌株的生产能力，在 3 L 发酵罐中进行补料分批发酵。优化发酵参数，包括培养基类型、葡萄糖浓度、溶解氧水平后，补料分批发酵条件下，异亮氨酸和缬氨酸的滴度显着增加到 857 mg/L 和 972 mg/L，与摇瓶发酵相比分别提高了 77% 和 57%。

不需要膳食糖（特别是葡萄糖）生产的氨基酸对于缓解未来的粮食危机将具有重要意义。研究发现，使用 CO₂ 作为单独碳源时，异亮氨酸产量可达 105 mg/L，在 25-30 天左右达到；缬氨酸产量可达 319 mg/L。

总体而言，本研究开发了产异亮氨酸和产缬氨酸的C. necator菌株。首次构建并系统设计用于异亮氨酸生产的柠檬酸途径。充足的前体供应、高效的目标产物外排、降低功率平衡、减轻反馈抑制和高效的 AHAS 在异亮氨酸和缬氨酸的生产中发挥着至关重要的作用。并首次实现在自养发酵中成功利用 CO₂ 生产 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸。

素材来源官方媒体/网络新闻

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