Sci Adv丨陈匡时团队通过单分子定位显微成像技术解析病毒Gag不同的组装过程

人类免疫缺陷病毒1型（Human Immunodeficiency Viruses type-1, HIV-1）是获得性免疫综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS）的主要致病毒株，其病毒颗粒形态为直径约为150 nm的球型，由数千个结构蛋白Gag和二聚体病毒基因组RNA（viral genomic RNA, gRNA）在宿主细胞膜上组装、出芽而成。病毒组装过程涉及广泛的gRNA-Gag以及Gag-Gag相互作用，在细胞膜上发生高程度的Gag-Gag多聚化，形成紧密的组装平台。有趣的是，在gRNA不存在的情况下，宿主细胞自身的mRNA也能介导Gag蛋白发生多聚化，最终产生在形态上与野生型病毒颗粒没有显著差异的类病毒颗粒（virus-like particles, VLPs）。目前，基于传统的显微成像技术以及生化实验手段，已有大量研究报道了gRNA介导的病毒颗粒组装行为，并且认为宿主细胞RNA介导的VLP组装具有与之类似的组装机制。然而，传统手段难以解析组装平台内部（<150nm）的分子行为。基于单分子定位显微（Single-molecule localization microscopy，SMLM）的超分辨率成像（空间分辨率可达约20 nm）以及蛋白分子定量技术的发展为在纳米尺度研究病毒蛋白组装行为提供了可能。

近日，北京大学未来技术学院陈匡时（ANTONY K. CHEN）课题组在Science Advances上发表题为Roles of RNA scaffolding in nanoscale Gag multimerization and selective protein sorting at HIV membranes的研究论文，通过单分子定位显微成像技术解析了gRNA与细胞RNA介导的Gag蛋白在纳米尺度下的组装行为，发现了两者具有不同的组装机制，并且影响后续HIV病毒包膜招募细胞膜蛋白的生物学过程。

研究者首先应用光激活定位显微成像技术（photoactivated localization microscopy, PALM）在有gRNA存在（gRNA+颗粒））或无gRNA存在（仅表达Gag，细胞RNA介导组装， gRNA-颗粒）的条件下对固定细胞膜上的Gag蛋白进行单分子信号采集以及蛋白聚落分析，发现在gRNA存在时，Gag蛋白聚落内的蛋白密度随着聚落半径的增加而呈现出“S”型的增长趋势，反映了在gRNA包装过程中Gag-RNA、Gag-Gag的相互作用具有协同效应。与之相比，细胞RNA介导形成的Gag蛋白聚落的平均蛋白密度更低、蛋白密度随聚落半径增长的协同性更低。接下来，研究者对活细胞膜上的Gag蛋白进行PALM信号采集以及单颗粒示踪，通过时间相关PALM方法（time-correlated PALM，tcPALM）分析组装平台形成过程，使用HMM-Bayes算法分析Gag蛋白单分子轨迹的运动行为，发现在包装细胞RNA时，Gag多聚体化并不是一个以聚落为中心（cluster-centric）的连续组装过程，反而表现为多个小聚落聚集的阶段式组装。此外，细胞RNA介导的Gag分子运动的平均扩散系数更大，且对于具有多种运动状态的Gag分子，其扩散系数的变化幅度也更大。基于以上结果，研究者提出以下的组装模型：二聚体gRNA（长度约18 kb）可以作为长链的支架协同驱动Gag发生多聚化，形成紧密的蛋白聚落，而由细胞RNA驱动的组装需要Gag在多条相对较短的细胞RNA上分别多聚化形成小聚落，再由小聚落发生进一步聚集形成更大的复合物，因此组装的协同性低，蛋白聚落更加松散。

为进一步探究gRNA与细胞RNA介导的Gag多聚化行为差异是否具有生物学上的意义，研究者比较了这两种条件下Gag组装平台对细胞膜蛋白的招募能力。前人研究表明，Gag多聚化会在宿主细胞膜上形成富集特定脂质组分的HIV包膜区域，进一步招募对这些脂质组分具有高亲和力的跨膜蛋白（lipid-based partitioning），实现HIV包膜的蛋白分选。研究者以MLV-Env这一已被证实可以被分选入HIV包膜的跨膜蛋白作为模型，对比了以上两种组装条件对MLV-Env招募的影响。结果表明，两种RNA介导的Gag组装平台内部均能富集MLV-Env蛋白，但值得注意的是，在细胞RNA介导下MLV-Env的富集水平更高，这可能是由于细胞RNA介导的Gag组装平台更加松散所导致的。以上结果提示，尽管MLV-Env可以通过脂质分选进入HIV包膜，其富集的水平可能会进一步受到位于细胞膜内叶Gag多聚化结构对其胞质尾区（cytoplasmic tail）的空间位阻效应的调控。

这一发现对于开发基于HIV VLP包装以病毒或非病毒跨膜蛋白为抗原的工程化疫苗开发具有重要意义。例如，该研究提示，与传统的减毒活疫苗和灭活疫苗相比，基于VLP的疫苗除了具有更高的安全性和更易制造等优势外，还能容纳更多的抗原，因此可能提供更强的治疗效力。此外，该研究也为VLP设计提供新的思路，即通过去除候选抗原胞质尾区的非必要成分，以提高颗粒表面的抗原密度。

北京大学未来技术学院陈匡时课题组博士研究生应亚宸为本文第一作者。课题组已毕业博士杨艳涛参与了本文前期工作。陈匡时研究员为本文的通讯作者。

https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.adk8297

本期来源： BioArtMED

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