《食品科学》：甘肃农业大学梁琪教授等：1株牦牛乳源产细菌素融合魏斯氏菌ZW21全基因组测序及序列分析

传统发酵牦牛乳在长期发酵过程中经自然驯化使传统牦牛发酵乳中具有丰富的乳酸菌，从中筛选得到的融合魏斯氏菌（Weissella confusa）ZW21具有较强的抑菌、抗氧化等功能活性。融合魏斯氏菌属乳杆菌目（Lactobacillales）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、魏斯氏菌属（Weissella），是一类有益乳酸菌。该菌属微生物多存在于酸奶、泡菜等各种发酵食品中，也定植于人体和动物的肠道中，具有避免肠道感染、促进消化吸收、降低胆固醇以及癌症发病率等作用。全基因组测序技术可通过对生物体进行测序得到其全基因组序列，进而分析物种间的相互作用和物种进化关系，从分子层面对生物体进行解读，从而挖掘功能基因，为筛选优良菌株奠定基础。

甘肃农业大学食品科学与工程学院郑雪，梁琪*，宋雪梅等人采用Illumina测序平台对W. confusa ZW21进行全基因组测序分析，并利用基因功能（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、蛋白质直系同源簇（COG）、非冗余蛋白（NR）、碳水化合物活性酶（CAZy）、转运蛋白分类数据库（TCBD）、Swiss-Prot和Pfam数据库进行基因功能注释，从基因水平揭示W. confusa ZW21的关键功能基因，旨在为其抗菌机理提供理论依据。

1W. confusa ZW21基因组组装及基因组组分

ZW21染色体基因组大小为2.44 Mb，总长度为2224179 bp，GC含量为45.66%。如表1所示，W. confusa ZW21全基因组中编码基因总长度为1947771 bp，有2175个编码基因，平均长度为896 bp，占基因组的87.57%；转座子30个，总长度为1908 bp，平均长度64 bp，占基因组的0.086%；长散在重复序列40个，总长度为2415 bp，平均长度61 bp，占基因组的0.109%；短分散重复序列18个，总长度为1122 bp，平均长度62 bp，占基因组的0.050%；tRNA 78个，总长度为5916 bp；基因岛5个，总长度为48800 bp。

由图1 可知，W. confusa ZW21的基因组最内圈（第1圈）是基因组序列位置坐标，其后由内而外第2～3圈分别为基因组GC Skew值分布、基因组GC含量，最外部2 圈为ncRNA及编码序列（coding DNA sequence，CDS），其中内圈为正链、外圈为反链。

2W. confusa ZW21基因注释

对预测得到的编码基因在GO、KEGG、COG、NR、TCDB和CAZy数据库进行功能注释，如表2所示，W. confusa ZW21在GO数据库中共注释到1445个基因，在COG数据库中共注释到1377个基因，在KEGG数据库中共注释到1817个基因，在NR数据库中共注释到2106个基因；在TCDB中共注释到219个基因；在CAZy数据库中共注释到77个基因。

2.1GO数据库注释

GO数据库分为细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）3 类。 如图2 所示，W. confusa ZW21在GO分类中共有1445个基因被注释，其中CC中富集基因数量最多的前3个功能条目分别为大分子复合物、细胞和细胞部分；MF中转运活性、催化活性和结合是基因数量最多的功能条目；BP中得到最多注释的前3个功能条目为代谢过程、细胞过程和定位。其中，与抗氧化活性相关的基因ID分别为GM000507、GM000577、GM001988，涉及免疫系统相关基因ID分别为GM000354、GM000169、GM000122、GM000963、GM001770。

2.2COG数据库注释

COG数据库是根据细菌、藻类和真核生物完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成。通过比对可以将蛋白序列注释到COG数据库中，进而推测该序列的功能。如 图3所示 ，W. confusa ZW21共有1377 个基因被注释，分布于23个COG条目中。参与复制、重组和修复的基因有93个，参与翻译、核糖体结构与生物合成的基因有183个，与转录相关的基因有83个，参与碳水化合物运输和代谢的基因有129个，参与氨基酸转运和代谢的基因有113个。

注释结果表明W. confusa ZW21具有参与合成MFS（major facilitator superfamily）转运蛋白功能的序列（Atg22家族），基因编号为GM000025；以及合成膜蛋白的功能序列（DUF1440家族），基因编号为GM000592。

2.3KEGG数据库注释

KEGG数据库将生物通路划分为8类，将W. confusa ZW21的氨基酸序列与KEGG数据库进行比对，将目标物种的基因与其相对应的功能注释信息结合。W. confusa ZW21菌株在KEGG数据库中共有1817个基因分别注释到细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、新陈代谢、组织系统6大功能的35个通路。如 图4 所示，W. confusa ZW21在代谢途径和遗传信息处理得到较多的基因功能注释。其中，817 个基因注释到代谢通路，在12个代谢通路中，碳水化合物代谢相关的基因为118个，占代谢通路注释基因的14.44%；131个基因在环境信息处理层面得到注释，其中与信号传导相关的基因为33个，与膜转运相关的基因为98个。

表3 所示为W. confusa ZW21在KEGG数据库中注释的关于免疫相关基因及其通路信息。W. confusa ZW21基因组中包含参与抗生素、生物降解等代谢过程的基因，以及可调控免疫和炎症通路（包括过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白受体（NLR））的组织系统通路相关基因。此外，W. confusa ZW21基因组还含有可调节金黄色葡萄球菌感染的通路map05150，涉及5种相关基因（GM000756、GM001068、GM001069、GM001070和GM001071），在感染疾病通路水平上参与拮抗金黄色葡萄球菌感染。W. confusa ZW21中基因GM001319参与原核生物糖代谢调控，参与新霉素、卡那霉素和庆大霉素等抗生素的生物合成；基因GM001149、GM001154、GM001155、GM00115参与单内酰胺类抗生素的生物合成；基因GM000115、GM001122、GM001123参与灵菌红素生物合成；基因GM000057、GM001133、GM001319参与链霉素生物合成。W. confusa ZW21中GM000458和GM001545参与PPAR信号通路的调控。W. confusa ZW21中1个基因（GM002091）参与NLR信号通路的调控。此外，W. confusa ZW21还存在编码抗叶酸的基因，包括GM001745、GM000317、GM001606、GM000868。

2.4NR数据库注释及系统发育分析

NR数据库注释结果中包含有物种信息，可用于物种分类。如图5A所示，有1739个基因注释为W. confusa。基于NCBI数据库已知的W. confusa全基因组和W. confusa ZW21全基因组，采用MAGE 7.0软件采用邻接法构建系统发育树。如图5B所示，W. confusa ZW21与W. confusa N17的亲缘关系最近，因此，将其鉴定为1株融合魏斯氏菌。

对W. confusa ZW21潜在的细菌素基因进行挖掘，如 表4 所示，W. confusa ZW21含有8个编码细菌素相关基因。其中，2个编码大肠菌素V基因（GM000070、GM001948），1个编码含双甘氨酸前导肽的II类细菌素基因（GM001064），1个编码ABC型抗菌肽转运系统的基因（GM001172），1个编码杆菌肽抗性蛋白BacA的基因（GM001752），1个编码乳球菌素家族的基因（GM000397），1个编码羊毛硫抗生素转运系统ATP结合蛋白nisF的基因（GM002164），以及1个编码ABC型转运蛋白ATP结合蛋白EcsA的基因（GM000146），证明该菌具有合成并分泌细菌素的潜力。

2.5W. confusa ZW21大肠菌素序列分析

将W. confusa ZW21大肠菌素的核苷酸序列翻译成氨基酸序列并在NCBI数据库中进行比对，如图6所示，W. confusa ZW21与W. confusa LBAE C39-2的大肠菌素生产蛋白序列（WP_003609935.1）完全相同。

2.6TCDB数据库注释

TCDB数据库是转运蛋白分类数据库，将W. confusa ZW21的氨基酸序列与TCDB数据库进行比对，结果如图7所示。ZW21存在初级活性转运蛋白123个、电化学电位驱动的转运蛋白61个。

2.7CAZy数据库注释

如图8所示，W. confusa ZW21共有77个基因被注释，其中碳水化合物结合结构域基因17个、糖酯酶基因2个、糖苷水解酶基因35个、糖基转移酶相关基因23个。

3讨 论

细菌素是由包括乳酸菌在内的一些微生物产生的一类强效抗菌肽，因其高效、广谱、安全的特性，目前被认为是抗生素的有效替代品。本研究通过对1株从发酵牦牛乳中分离得到的W. confusa ZW21进行全基因组测序和生物信息学分析，解析了W. confusa ZW21的基因组结构和具体功能。通过NR、Pfam、Swiss-Prot等数据库在W. confusa ZW21基因组中共注释得到包括大肠菌素V和乳球菌素家族在内的5种已知的细菌素相关基因。本研究将W. confusa ZW21翻译得到的蛋白序列与W. confusa A3和W. confusa LBAE C39-2产生的V族大肠菌素进行对比后发现，3 株菌株的产大肠菌素V的序列完全相同。此外，本研究在W. confusa ZW21基因组中发现编码乳球菌素家族（GM000397）、羊毛硫抗生素转运系统ATP结合蛋白nisF（GM002164）及ABC型转运蛋白ATP结合蛋白EcsA（GM000146）的基因，表明该菌株可能具有产生乳球菌素的潜力。乳酸菌细菌素是由乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，具有显著抑制革兰氏阳性细菌的能力。本研究结果也显示W. confusa ZW21具有联产大肠菌素V和乳球菌素的能力，表明其具有对革兰氏阴性菌和阳性菌的广泛抑制能力。

课题组前期研究表明W. confusa ZW21具有抗氧化活性，这与W. confusa ZW21的抗氧化基因密切相关。通过GO注释分析发现，W. confusa有3个基因参与抗氧化过程，5个基因参与免疫过程。COG注释结果中发现参与合成胆汁耐受基因（MFS型转运蛋白功能Atg22序列）和耐酸基因（DUF1440家族序列），与W. confusa ZW21的耐酸、耐胆盐特性相吻合。此外，KEGG数据库的注释结果表明，W. confusa ZW21基因组注释到调控免疫和炎症的PPAR和NLR通路，其中PPAR信号通路与能量代谢、细胞分化、增殖、凋亡和炎症反应密切相关；NLR可以通过识别细菌细胞壁成分、微生物毒素等外源物质进而参与拮抗入侵细菌，且被证明与炎症反应密切相关。W. confusa ZW21还含有编码抗叶酸相关基因，抗叶酸是第一类抗代谢药物，已被证明在治疗癌症和炎症性疾病中有效。已有研究证实，W. confusa的存在可减轻炎症反应，具有成为抗感染强效治疗剂的潜力和预防癌细胞增殖的功能。

结 论

本研究通过对1株牦牛发酵乳源W. confusa ZW21进行全基因组测序，从基因层面对该菌株的抗菌机理进行解析。结果表明，W. confusa ZW21基因组大小为2.44 Mb，有2175个编码基因；W. confusa ZW21含有8种细菌素相关基因，具有合成大肠菌素V及乳球菌素的潜力，其产生的细菌素分别对革兰氏阴性和阳性菌具有抑制作用；除合成基因外，该菌株还具有参与细菌素分泌及赋予菌株细菌素抗性的基因，证明该株W. confusa ZW21具有分泌细菌素且不被自身所分泌的细菌素杀灭的能力。但目前极少有关于W. confusa产大肠菌素的报道，因此其产生及分泌的机制仍不清楚。本研究对W. confusa ZW21的全基因组测序分析丰富了W. confusa的生物信息学数据库，后续可通过代谢组学的方法深入研究该菌株分泌大肠菌素及乳球菌素的代谢通路，探索其产生机制及其对致病菌的抑菌机理，并进一步对W. confusa ZW21所产细菌素的安全性进行评估，为推进该菌株在食品保鲜及防腐方面的应用研究提供理论依据。

本文《1株牦牛乳源产细菌素融合魏斯氏菌ZW21全基因组测序及序列分析》来源于《食品科学》2023年44卷第20期119-126页，作者：郑雪，梁琪，宋雪梅，张炎。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221126-303。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南农业大学食品科技学院 李曦明；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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