FSHW | 益生菌发酵对香菇多糖结构和免疫调节活性的影响

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"Introduction"

香菇多糖是香菇子实体和菌丝体细胞壁的主要成分。越来越多的研究证据表明，香菇多糖是一种重要的大分子物质，具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性。多糖的生物活性受其理化特性和结构的影响，包括单糖组成、 分子量 （Mw）、糖苷键的类型和分支程度等。例如，香菇多糖三螺旋构象的消除显著降低了其抗肿瘤活性，香菇多糖对脂质过氧化的抑制与多糖的单糖组成有关。

乳酸菌发酵已应用于食品保存及食品感官和功能特性改善等方面。迄今为止的研究表明，发酵会影响植物多糖的结构和功能。例如，植物乳杆菌NCU116发酵苦瓜，引起其多糖结构发生变化并赋予其更强的抗糖尿病活性。同样，植物乳杆菌NCU 116发酵胡萝卜导致胡萝卜多糖的平均分子量降低，并增强其抗糖尿病功能。芽孢杆菌DU-106发酵改变了铁皮石斛多糖的分子量和单糖组成，使铁皮石斛多糖成为一种潜在的免疫调节剂，以缓解疾病。然而，关于乳酸菌发酵对食用菌多糖结构和生物活性影响的报道很少。香菇多糖是一种极性大分子化合物，其特殊结构与免疫活性密切相关。因此，通过乳酸菌发酵获得具有免疫调节功能的改性多糖对疾病干预策略的设计具有重要意义。

西北农林科技大学食品科学与工程学院的梁静静博士、张美娜硕士、高振鹏教授及团队通过测定9种益生菌菌株在香菇中的耐酸性、耐胆盐性、肠道粘附性和可发酵性筛选得到一株适于发酵香菇汁的益生菌菌株（发酵乳杆菌21828）。将发酵乳杆菌21828应用于香菇发酵，测定了发酵对香菇多糖结构和免疫调节活性的影响。

"Results and Discussion"

香菇多糖的分离与纯化

香菇发酵液和香菇未发酵液经水提、醇沉、脱蛋白、脱色和透析处理后冻干的香菇粗多糖NF-LEP和F-LEP。为了去除多糖中的杂质，提高香菇多糖的纯度，首先采用DEAE-52层析柱进行纯化，洗脱曲线如图1A-B所示。收集、合并主要组分NF-LEP-2和F-LEP-2，透析后，经Sephadex G-100色谱柱再次纯化，以超纯水为洗脱液，洗脱曲线如图1C-D所示。NF-LEP-2和F-LEP-2经超纯水洗脱后均只得到一个单一对称的主峰，说明F-LEP-2a和NF-LEP-2a的纯度较高。

NF-LEP-2a和F-LEP-2a的理化性质

利用HPAEC测定了样品中八种单糖组分的含量。结果发现发酵乳杆菌21828发酵略微改变了香菇多糖的单糖组成，葡萄糖的含量在发酵后增加，而其他七种单糖组分的含量在发酵之后有所降低。如图2所示，NF-LEP-2a和F-LEP-2a的HPGPC光谱均仅显示一个峰，说明二者的纯度都较高。NF-LEP-2a和F-LEP-2a的分子量分别为11.57和18.72 kDa，这一结果说明益生菌发酵增加了香菇多糖的分子量。益生菌发酵对香菇多糖微观形态的影响如图3所示。NF-LEP-2的表面相对光滑，有少量的突起和附着的碎片，而F-LEP-2的表面有许多孔隙和裂纹，以及附着的大量碎片。香菇多糖表面形貌的差异表明，发酵改变了香菇多糖的结构特征，因为形态的差异可能归因于内部分子结构的差异。

甲基化和NMR分析

甲基化分析表明，NF-LEP-2和F-LEP-2的结构较为复杂，均具有16种连接方式的糖残基，二者的键合模式相似，但仍有不同。为了进一步得到发酵前后香菇多糖样品的结构特征信息，对其进行一维核磁1H-NMR、13C-NMR和二维核磁1H-1H COSY、HSQC、HMBC测定。由NF-LEP-2a的NMR谱图可知，其1H谱和13C谱的异头区域较复杂。结合单糖组成和甲基化分析结果，发现有8个异头氢信号和异头碳信号峰可用来进行结构分析。在异头信号归属确定之后，通过COSY、HSQC和HMBC，结合1H-NMR和13C-NMR谱图以及甲基化结果，对样品所含有的主要类型糖残基的1H和13C化学位移信号进行归属。结合NMR谱图进行分析，各糖残基结构的分析如下：δ 4.45/105.57表明该残基为β构型，结合二维谱图推断该残基为→6)-β-D-Glcp-(1→，δ 4.47/105.57、δ 4.67/105.43和δ 4.73/104.45处的信号是β-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Glcp-(1→和→3)-β-D-Glcp-(1→。另外，δ 4.92/100.52和δ 5.07/101.15处的信号分别对应为→6)-α-D-Galp-(1→和→2,6)-α-D-Galp-(1→，δ 5.02/104.20为α-D-Manp-(1→，δ 4.99/100.66为α-L-Fucp-(1→。

NF-LEP和F-LEP对免疫抑制小鼠的保护作用

如图4，NF-LEP和F-LEP对小鼠脾脏指数的影响呈剂量依赖性，且中、高剂量组的NF-LEP和F-LEP可以增加脾脏指数；发酵前后的香菇多糖均可以不同程度修复小鼠的氧化损伤，提高小鼠的抗氧化能力；NF-LEP和F-LEP的各剂量组均可以提高血清IgG的含量，但仅高剂量组下的NF-LEP和F-LEP作用显著，且高剂量F-LEP的作用最佳，NF-LEP组和F-LEP组对血清IgM的提高具有剂量依赖性；NF-LEP和F-LEP可以增加免疫抑制小鼠的细胞因子水平，且F-LEP的效果更好；高剂量的NF-LEP和中、低剂量的F-LEP能够明显增加绒毛长度（P＜0.05），其他各组对改善肠绒毛长度没有显著影响，对于肠壁厚度，NF-LEP组和F-LEP组均能够改善肠壁厚度，且呈剂量依赖性。

NF-LEP和F-LEP对肠道菌群多样性的影响

通过测定小鼠肠道菌群多样性发现小鼠粪便菌群主要由8个菌门、25个菌科所构成，二者均能够增加肠道菌群的丰富度和多样性，且相同剂量下，F-LEP的调节作用强于NF-LEP。如图5所示，与模型组小鼠相比，各剂量下的NF-LEP和F-LEP对厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）的比例具有改善作用，使其接近正常组小鼠，说明NF-LEP和F-LEP均能够改善免疫抑制造成的肠道菌群失衡，使其向正常菌群组成发展，其中F-LEP中剂量组的F/B比值（2.28）最接近正常组小鼠（F/B＝2.11）。NF-LEP和F-LEP均能够通过增加乳酸杆菌科、毛螺菌科，降低理研菌科、Muribaculaceae、拟杆菌科来调节小鼠肠道菌群的构成，缓解肠道菌群失衡，对恢复肠道健康具有促进作用。

"Conclusion"

本研究选用发酵乳杆菌21828发酵香菇，从非发酵和发酵液中分离纯化水溶性香菇多糖（NF-LEP-2a和F-LEP-2a）。虽然NF-LEP-2a和F-LEP-2a具有相似的功能基团，但乳酸菌发酵改变了NF-LEP-2 a的单糖组成。进一步分析表明，NF-LEP-2a和F-LEP-2a之间的连接模式和核磁共振谱相似。体内免疫调节活性检测表明，发酵香菇多糖对免疫抑制小鼠有较好的保护作用。

第一作者

梁静静，女，现为西北农林科技大学食品科学与工程学院2020级在读博士研究生，主要研究方向为多糖与肠道菌群互作；肠肝轴等。

张美娜，女，为西北农林科技大学食品科学与工程学院2018级硕士研究生，主要研究方向为多糖分离纯化；多糖功能性研究等。

通信作者

高振鹏，男，博士，教授/博导。近年来以第一作者/通讯作者发表论文50余篇，第一申请人获批及申报专利15项，主持国家重点研发计划课题、子课题等项目20余项，获得省部级科技成果奖4项，副主编及参编教材5部。研究领域：果蔬加工及安全控制；食品工程新技术；天然产物提取及分离技术。

Structure and immunomodulatory activity of Lentinus edodes polysaccharides modified by probiotic fermentation

Jingjing Lianga,1, Meina Zhanga,1, Xiaohan Lia, Yuan Yueb, Xiaowei Wanga, Mengzhen Hana, Tianli Yuea, Zhouli Wanga, Zhenpeng Gaoa,*

a College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

b Beijing Key Laboratory of Plant Resource Research and Development, BeijingTechnology and Business University, Beijing 100048, China

c Department of Breast Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Plant-based fermentations provide an untapped source for novel biotechnological applications. In this study, a probiotic named Lactobacillus fermentum 21828 was introduced to ferment Lentinus edodes. Polysaccharides were extracted from fermented and non-fermented L. edodes and purified via DEAE-52 and Sephadex G-100. The components designated F-LEP-2a and NF-LEP-2a were analyzed by FT-IR, HPGPC, HPAEC, SEM, GC-MS and NMR. The results revealed that probiotic fermentation increased the molecular weight from 1.16 × 104 Da to 1.87 × 104 Da and altered the proportions of glucose, galactose and mannose, in which glucose increased from 45.94% to 48.16%. Methylation analysis and NMR spectra indicated that F-LEP-2a and NF-LEP-2a had similar linkage patterns. Furthermore, their immunomodulatory activities were evaluated with immunosuppressive mice. NF-LEP and F-LEP improved immune organ indices, immunoglobulin (IgG and IgM) and cytokines concentrations;restored the antioxidation capacity of liver;and maintained the balance of gut microbiota. F-LEP displayed better moderating effects on the spleen index, immunoglobulin, cytokines and the diversity of gut microbiota than NF-LEP (200, 400 mg/kg). Our study provides an efficient and environment-friendly way for the structural modification of polysaccharides, which helps to enhance their biological activity and promote their wide application in food, medicine and other fields.

Reference:

LIANG J J, ZHANG M N, LI X H, et al. Structure and immunomodulatory activity of Lentinus edodes polysaccharides modified by probiotic fermentation[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(1): 421-433. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250036.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意