【前沿&进展】皮下注射抗PD-1纳米抗体抑制SFTSV在人源化小鼠中的复制

南京大学吴稚伟课题组近日在EMBO发表了针对发热伴血小板减少综合症的单域抗体治疗的动物研究进展。发热伴血小板减少综合征（ Severe fever with thrombocytopenia syndrome ，SFTS）是由新型布尼亚病毒（ Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus ， SFTSV）感染引发的新发蜱虫传染病， 2 019 年，国际病毒分类委员会将其更名为大别班达病毒（ Dabie bandavirus，DBV ）。主要临床表现包括高热、血小板减少、白细胞减少、出血和胃肠道症状及多器官功能障碍等，病死率为 6-30% 。 在过去的 10年 里 ，中国疾病预防控制中心报告SFTS发病率整体呈上升、扩散趋势，具有明显时空聚集性 。 迄今为止，尚无针对 SFTS的有效疗法和疫苗 ，疾病发病机制仍不清楚。 2018年，世界卫生组织（World Health Organization ， WHO）将SFTS列为危害公众健康的重要传染病之一，需要优先 进行 研究和干预。

免疫检查点分子，是免疫细胞上表达的受体，触发免疫抑制信号通路，并在维持自体耐受性和调节影响外周组织的免疫反应中起关键作用。程序性细胞死亡蛋白 1（Programmed Cell Death Protein 1, PD-1 ） /程序性细胞死亡配体1（Programmed Cell Death Ligand-1, PD-L1）是一种重要的抑制性检查点信号通路， 可抑制癌症和病毒感染的免疫反应 , ，其在丙型肝炎病毒（ Hepatitis C virus, HCV）、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）等慢性病毒感染期间抑制免疫力的作用已经得到充分证实 , 。然而， PD-1/PD-L1在 SFTS 进展中的作用尚不清楚。

考虑到 SFTSV的基因型多样性 ，缺乏特异性治疗药物以及病毒特异性免疫与存活率之间的相关性， 本研究 探索阻断PD-1/PD-L1通路是否可以抑制SFTSV复制并作为一种免疫治疗干预措施。 首先，我们收集了 2022年3月至7月来自南京大学附属鼓楼医院SFTS患者和健康志愿者的全血（各15例），采用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMCs）；利用流式细胞术 进行 分析 ，结果揭示了 SFTSV感染后免疫细胞 上的 PD-1/PD-L1表达升高 。其次，为了进一步探索靶向 PD-1的抗体是否可以抑制SFTSV复制，我们首先构建了一个来自免疫羊驼的抗PD-1蛋白的纳米抗体噬菌体文库，通过对PD-1蛋白VHH噬菌体文库进行多轮富集生物淘选， 我们 分离并自主制备出了高亲和力抗PD-1纳米抗体（NbP45），用于阻断PD-1/PD-L1通路。

体外功能实验揭示： 与 S FTSV （ subtype E, JS-2013-24 ）病毒感染组 相比 ， NbP45 治疗组的 病毒 RNA 拷贝数减少 约 1.0×10 7 拷贝 数 /ml ， 显 著 抑制 了病毒的 复制 ；此外，治疗组中 CD8 + /CD4 + T细胞的比例显著上调 ， annexin V + 在 CD4 + /CD8 + T细胞中的表达明显下调 ，而 CD4 + 或 CD8 + T细胞 中 的 HLA-DR、Ki-67 或 IFN-γ 表达水平 显著 升高，表明 抗体阻断 PD-1/PD-L1 通路 后T淋巴细胞被激活 。揭示了 NbP45 有效减缓了T细胞的凋亡，促进其增殖，并抑制了S FTSV 在P BMC s细胞中的复制。随后采用 SFTSV亚型 D （ 20ZJTZ07 ）或 B （ HB29 ）体外感染P BMC s细胞 ， 结果显示 NbP45 同样显著抑制了病毒的复制，揭示了P D-1 抗体的 广谱 性(Figure 1)。

为了评估 NbP45的体内疗效， 我们 采用具有人外周血 单个核细胞 的人源化 NCG 小鼠（NCG-HuPBL）模型， 并建立了 SFTSV （ subtype E, JS-2013-24 ） 感染的NCG-HuPBL小鼠模型 。 随后，将 NbP45通过 腹腔（ i.p.）或皮下 （ s.c.） 注射的给药方式，在病毒感染后第 1、3 、 5和7 的特定时间进行治疗。体内实验分析结果显示：与感染组相比， NbP45 采用皮下注射治疗第 9天病毒 R NA 拷贝数减少约 2 个 log 10 ， 第1 2 和1 5 天 减少 约1个 log 10 ，显著抑制了 SFTSV 在 NCG-HuPBL小鼠 中的 复制 ；并且明显提高了 血小板计数， 揭示 其预防病毒诱导的血小板减少症的能力 。此外，采用皮下给药的 NbP45 治疗组 显示 人外周血单个核细胞 中 的 CD8 + /CD4 + T细胞比例显 著 增加 ，且体内血清 NbP45 抗体浓度下降缓慢。揭示了在 NCG-HuPBL小鼠模型中，通过皮下注射NbP45可有效抑制SFTSV复制并缓解病毒诱导的血小板减少症(Figure 2)。

综上所述，本研究显示 PD-1 在 SFTSV急性 感染治疗中的作用 ， 可以作为 治疗SFTSV 的 潜在免疫 宿主靶点，并进行下一步 干预措施 的 开发 。而针对其他免疫检查点 PD-L1、CTLA-4、CD47、TIGIT等 抗体在S FTSV 感染中的作用 ，需要进一步 深入 研究。 此外，采用针对免疫检查点的抗体进行治疗具有几个独特的优势：（ 1）虽然SFTSV有6种不同的基因型和多种不同的血清型，但针对免疫检查点的治疗不容易受到不同基因型的影响;（2）靶向免疫检查点可以克服高度突变RNA病毒的内在性质;（3）通过激活免疫系统可以达到更有效的抑制和清除病毒的目的。

这项研究工作近日以I nhibition of SFTSV replication in humanized mice by a subcutaneously administrated anti-PD1 nanobody 为题发表于EMBO -Molecular Medicine 。论文共同第一作者吉萌萌和胡嘉倩分别为宁夏大学生命科学院和南京大学医学院博士生，南京大学附属鼓楼医院陈雨欣，宁夏大学生命科学院王玉炯，南京大学吴喜林和吴稚伟为共同通讯作者。 本研究获得国家自然科学基金（ National Science Foundation of China (NSFC) ）( No. 32370988, 31970149 and U22A20335 ) ， 科技重大专项 （2018ZX10301406）和南京大学-宁夏大学 联合 项目（Grant#2017BN04）的支持。

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