亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸最大滴度分别为22.46、27.62和6.28g/L

丙酮酸作为氨基酸和各类工业化学品生物合成的重要组成部分，其处在糖酵解途径和三羧酸（TCA）循环的上游。这种情况导致高达 50% 的丙酮酸以二氧化碳的形式损失。

2 月 5 日，来自中国科学院微生物研究所的温廷益、张芸团队发表论文Model-guided metabolic rewiring to bypass pyruvate oxidation for pyruvate derivative synthesis by minimizing carbon loss，该团队基于 T7 RNAP-sRNA 系统调节基因表达，建立了一种新的葡萄糖生长细菌代谢模式。从而在维持生长适应性并最大限度减少有氧条件下碳损失的基础上，合成丙酮酸衍生产品。

研究结果表明，构建的工程化菌株能够分别达到 L-亮氨酸的最大滴度为 22.46 g/L、L-丙氨酸最大滴度为 27.62 g/L 以及 L-缬氨酸最大滴度为 6.28 g/L。

（来源：Applied and Industrial Microbiology）

在利用葡萄糖的有氧代谢过程中，丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）氧化生成乙酰辅酶 A，为 TCA 循环提供能量。值得注意的是，该途径导致高达 50% 的丙酮酸通过二氧化碳损失，而另一部分丙酮酸则被募集合成氨基酸。这就说明丙酮酸节点的代谢通量具有灵活、可调节的特性。

对此，研究团队采取提高丙酮酸利用率的策略，通过改造大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌以阻止丙酮酸氧化，从而最大程度地减少丙酮酸经二氧化碳所造成的消耗。

该项研究中，研究人员使用高效的遗传工具和适应性实验室进化（ALE）工具开展中心碳代谢重编程，以生产丙酮酸衍生的 L-丙氨酸、L-缬氨酸和 L-亮氨酸。根据谷氨酸棒杆菌模型 iCW773 模拟结果表明，L-丙氨酸、L-缬氨酸和 L-亮氨酸的合成能够与丙酮酸损耗途径形成竞争。

为了修改 L-亮氨酸合成途径以提升产量，研究人员逐步进行途径改造，通过提升 leuC、leuD 和 leuB 基因的转录水平，使 LtbR 失活以及删除 alaT、ldhA 和 pyc 等方式，提升 L-亮氨酸滴度。

▲图丨L-亮氨酸积累的计算机设计和重编程丙酮酸代谢（来源：Applied and Industrial Microbiology）

在此之后，研究团队进一步构建了约 3,000 个前导顺反子变体的文库，以在翻译阶段微调目标基因的表达。该团队通过表达异源的双功能磷酸解酮酶（FxpK），引入双歧分流途径使一分子葡萄糖生成三分子非丙酮酸衍生的乙酰辅酶 A，从而绕过丙酮酸的氧化。

接下来，研究者通过噬菌体 T7 RNA 聚合酶（T7 RNAP）介导的 sRNA 开关动态下调 TCA 循环，该方法能够以可控的方式调节细胞生长和 L-亮氨酸生物合成之间丙酮酸通量分布。数据表明，携带PT7(C4)-anti-aceE和PT7(H9)-anti-gltA sRNAs 的菌株其 L-亮氨酸产量比没有表达 sRNA 时的结果高 16%。

另一方面，基于此前代谢工程领域的发现，研究团队在底盘菌株中建立了有氧条件下葡萄糖的新代谢模式。利用乙醛酸分流作为唯一的 C4 回补途径，结合双歧分流作为非丙酮酸衍生的乙酰辅酶 A 合成途径，可最大限度地减少碳损失。

经补料分批发酵，在生物反应器中反应 55 小时 L-亮氨酸的最大滴度达到了 22.46 g/L，已接近于该物质溶解度。对于 L-丙氨酸的合成而言，通过编码来自球形赖氨酸芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶可构建新的合成途径，然后使用 sRNA 开关动态控制丙酮酸分配。在摇瓶培养中，最大 L-丙氨酸滴度可达 27.62±0.44 g/L。L-缬氨酸的生产也类似于上述情况，其产量可达到 6.28±0.27 g/L。

▲图丨用于生产丙酮酸衍生产品的工程化底盘细胞和发酵结果（来源：Applied and Industrial Microbiology）

本次研究在细胞水平上通过“过程控制”，实现了对于丙酮酸通量的动态控制，从而让细胞资源在生长和生产之间被按需分配。该过程中，T7 RNAP 介导的 sRNA 工具箱实现了对于多种基因表达的调节，其能够在基因组规模上构建用于代谢网络调控的 RNAi 文库。

总体而言，该研究建立了一种新型的葡萄糖生长细菌代谢模式，能够最大限度地减少有氧条件下的碳损失，并为制造丙酮酸衍生产品的细胞设计提供了宝贵的见解。

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