黄酮类化合物滴度最高提升10倍，格罗宁根大学团队设计酶组合策略

黄酮类化合物（flavonoids）是一类天然多酚化合物，广泛存在于自然界的植物中，属于植物次生代谢产物。目前，已经鉴定出了超过 15,000 种黄酮类化合物，许多已被证明具有药用价值，包括抗癌、抗炎、抗突变和抗氧化特性，可用于生产营养保健品、药物和化妆品。

合成生物学为生产各种黄酮类化合物提供了特异性和自下而上的方法。不过，目前黄酮类化合物的生产效率仍然很低。

近期，来自荷兰格罗宁根大学的研究团队提出了一种显著提高黄酮类化合物产量的方法。在研究中，该团队研究并设计了一种酶组合，确定了催化该途径第一个关键步骤中酶的晶体结构，并构建变体、评估这些变体在大肠杆菌中合成甲基化黄酮类化合物的性能。

论文中指出，性能最佳的变体 HvCHS（Q232P、D234 V）菌株生产的 O-甲基化黄酮类化合物高圣草酚和橙皮素比之前报道的生产滴度分别高 2 倍和 10 倍。这一研究结果有助于进一步改造催化酶，从而提高甲基化黄酮类化合物的产量。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

该研究已发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上。本研究的第一作者是 Bo Peng，通讯作者是Kristina Haslinger。Kristina Haslinger 是格罗宁格大学药物生物学助理教授，研究的重点是构建微生物细胞工厂，用于生产药用天然产品。

基于微生物细胞工厂生产黄酮类化合物的方式多种多样。一种策略取决于预先组装的类黄酮支架，然后利用植物细胞色素 P450 酶和 O-甲基化转移酶（4′-O-methyltransferase，OMT） 对该支架进行修饰；另一种是建立从简单的甲基化羟基肉桂酸（例如阿魏酸和异阿魏酸）开始的生物合成途径，这种基于前体合成的方法建立在 4CL 和 CHS 酶发挥作用的基础上。

此前，已经有研究团队通过构建表达来自水稻的 4CL (Os4CL) 和来自大麦的 CHS（HvCHS）的重组大肠杆菌菌株，以甲基化羟基肉桂酸为底物合成了较低滴度的橙皮素，约为 0.4 mg/L。滴度较低的原因可能与酶组合中酶的活性相关，亦可能与阿魏酸和异阿魏酸是这些酶的不良底物相关。

在这项研究中，以此前领域内的研究进展为基础，该团队决定进一步探索这种酶组合的催化潜力。该团队确定了 HvCHS 与 CoA、CoA 和柚皮素以及 CoA 和圣草酚的晶体结构。基于这些结构，研究团队设计了突变体，以此希望提高阿魏酸和异阿魏酸在大肠杆菌中生产 O-甲基化黄酮类化合物圣草酚和橙皮素的滴度。

（来源：上述论文）

在 1 mL 规模的初始发酵实验中，添加阿魏酸和异阿魏酸到 1 mM 浓度，研究人员观察到 HvCHS 和 Os4CL (s2) 的组合生产的高圣草酚滴度比其他酶生产的滴度高出 2 倍。然后，继续设计 4CL 酶变体与 O-甲基化底物反应，进一步提高橙皮素和高圣草酚的滴度。

接下来，该团队通过 X 射线晶体学和定点诱变确定 HvCHS 与配体 CoA、柚皮素和圣草酚的晶体结构，继续研究 CHS 在底物选择中的作用。为了探究这些微小序列差异对用于生产体内甲基化黄酮类化合物的酶性能的影响，研究团队决定生成 HvCHS 和 PhCHS 的多个变体。

该团队筛选出性能最佳的突变体，并将这两个突变体组合成双突变体 HvCHS（Q232P 和 D234V），接着通过质粒转化到大肠杆菌中。该菌株 S17 产生的甲基化类黄酮滴度比其他所有菌株更高，最终高圣草酚滴度比表达野生型 HvCHS 的菌株 s2 高 2 倍，橙皮素滴度比野生型菌株高 3 倍。

▲图 | 表达 CHS 变异体的大肠杆菌小规模发酵生产黄酮类化合物（来源：上述论文）

随后，研究人员探索了 HvCHS 变体是否可以进一步提高甲基化黄酮类化合物的滴度，并在摇瓶中进行了更大规模的发酵。构建的 S18 菌株生产高圣草酚和橙皮素的滴度分别为 0.24 mM 和 0.011 mM。通过对比，双突变体 Q232P 和 D234V 的菌株 S17 生产甲基化黄酮类化合物的滴度最高，高圣草酚为 0.33 mM，橙皮素为 0.016 mM。

接下来，研究团队利用性能最佳的菌株在摇瓶中测试了生产滴度，32 小时后，高圣草酚和橙皮素的滴度分别达到了 41 mg/L 和 45 mg/L。

素材来源官方媒体/网络新闻

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