产量达46.27g/L，科学家工程化改造链霉菌合成靛蓝

服装行业每年使用靛蓝为 10 亿条牛仔裤着色。

靛蓝是目前人类所知最古老的色素之一，也是应用于纺织印染行业最古老的染料之一。根据相关记载，靛蓝色素作为织物染料的历史可以追溯到 6000 多年前。2009 年，考古学家在秘鲁发现了一块被染成靛蓝色且具有 6200 年历史的布料；早前在埃及法老第五王朝墓中发现的靛蓝染色花边距今已有 4400 多年，公元前 2600 年，印度就有使用靛蓝的文献记载，中国马王堆出土由靛蓝所染的蓝色麻织物也具有 2000 多年的历史。

在历史的长河中，靛蓝的生产方式从古代的植物浸泡到近现代的化学合成，并逐步进入生物合成时期。

靛蓝主要由L-谷氨酰胺经靛蓝合成酶缩合反应合成，靛蓝合成酶 IndC 大部分来源于链霉菌属。然而，链霉菌代谢开关复杂，因此全面优化其生产力是一个挑战，这使得链霉菌难以生产低附加值的大宗化学品。因此，大部分研究人员选择在异源宿主如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等中过表达 IndC，以实现靛蓝的高水平生产。

考虑到链霉菌大规模培养过程中低成本培养基和简单培养条件的优势，来自安徽工业大学、上海健康医学院和华东理工大学的研究人员设计了一个能够高表达 IndC，且更容易调控的链霉菌。

该菌株以工业甘油作为补充碳源培养工程菌株，在烧瓶和 4L 发酵罐中分别可以得到 14.3g/L 和 46.27g/L 的靛蓝，达到了微生物合成靛蓝的最高水平。为链霉菌细胞工厂生产靛蓝的工业化应用奠定了基础。

相关研究以题为“Establishment of an Efficient Expression and Regulation System in Streptomyces for Economical and High-Level Production of the Natural Blue Pigment Indigoidine”发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊。

在前期的研究中，研究人员就基于链霉菌设计了一个链霉菌调控系统 StSS，包括组成型启动子、sigma 因子σhrdB和链霉菌次级代谢启动子，并被组装成两个模块：初级代谢模块（PM）和次级代谢模块模块（SM）。σhrdB转录因子对基因转录调控的影响显著，它对绝大多数基因，特别是与初级代谢物相关的基因进行全局调控。已有研究证明，σhrdB之外的其他 sigma 因子多数转录强度要低于σhrdB。

PM 包含内源σhrdB和σhrdB依赖性组成型启动子 P12-16（PkasO* 突变体），用于在初级代谢阶段表达靶基因；SM由次要代谢启动子控制下的σhrdB表达盒组成(PRVR2353)，其在次级中维持σhrdB依赖性启动子的连续活性代谢阶段不断积累目标代谢物。

StSS 用于调节变铅青链霉菌 TK24 中 IndC 的表达，从而在烧瓶发酵中获得 5.2g/L 的靛蓝。为链霉菌中靛蓝产量最高的，但与其他报道的微生物细胞工厂相比，这种工程化链霉菌菌株的生产力不足。因此，StSS 的优化对于提高工程链霉菌高水平靛蓝生物合成的生产力至关重要。

然而，由于链霉菌初级代谢阶段σhrdB表达不足，导致初级代谢阶段代谢产物的生产率远低于次级代谢阶段，严重限制了链霉菌中的高水平生产目标代谢物。

因此，在本研究中，通过启动子工程策略优化σhrdB在 StSS 中的表达模块，以提高初级代谢阶段靛蓝的生产力。

▲图 | 用于调节靛蓝生产的链霉菌全局增强系统（StGES）的设计和示意图。(A) 靛蓝的代谢途径；(B, C) StGES 下靛蓝生产的理想代谢调节（来源：上述论文）

在这项研究中，三个启动子 PRVR2030、PRVR6682 和 PRVR9017 被验证活性强度，最终选择了在整个代谢阶段均具有活性且在初级代谢阶段具有更有效强度的 PRVR2030 来优化σhrdB的表达，并重建 StGES来调节靛蓝的产生。优化的链霉菌调控系统被命名为 StreptomycesGlobal 增强系统（StGES）。

结果发现，工程菌株 StGES-IndC 在初级代谢阶段的靛蓝产量显著增加，这表明重建的调控系统 StGES 可以通过增加σhrdB的表达来有效增强靛蓝的生物合成。此外，次生代谢阶段在 StGES的调控下能够持续产生靛蓝，工程菌株 StGES-IndC 在摇瓶中 96h 时，靛蓝产量达到 12.39g/L。

考虑到靛蓝的前体来源于糖酵解途径和 TCA 循环，并且培养基中的葡萄糖在发酵后仅 24h 左右就被耗尽，因此，分别在 24h 时向培养基中添加葡萄糖和甘油。甘油作为补充剂优于葡萄糖，工程菌株 StGES-IndC 在添加 1%（w/v）甘油后，96h 靛蓝产量达到 14.95g/L。进一步提高了工程菌株 StGES-IndC 生产靛蓝的能力，为链霉菌细胞工厂工业化生产靛蓝奠定了基础。

有趣的是，在培养基中添加甘油后，工程菌株 StGES-IndC 的生物量显著增加。考虑到 StGES-IndC 没有进一步重建代谢途径，因此，生物量的提高可能是靛蓝产量增加的原因。在 StGES 的调控下，工程菌株的生物量增加了 25%，且工程菌株的孢子化时间由 120h 提前至 72h。

为了验证菌株 StGES-IndC 的实际应用价值，使用 4L 发酵罐进行批量处理。结果表明，12h 后靛蓝的生产滴度迅速积累，且初级代谢阶段靛蓝碱的生产率高于次级代谢阶段，有利于降低能源消耗。

▲图 | 在 4L 批量生物反应器中高密度发酵 StGES-IndC，以刺激靛蓝生产。(A)补料分批发酵过程示意图；(B) 用于靛蓝生产的高密度发酵。时间进程显示菌株 StGES-IndC 的细胞生长和靛蓝生产的变化。红色箭头代表将甘油加入到培养基中。

120h 后，通过补料分批培养技术，靛蓝滴度达到 46.27g/L，这是迄今为止报道的最高滴度之一。考虑到廉价的工业培养基和甘油用于补料分批培养，菌株 StGES-IndC 的优异性能展现了靛蓝生产的应用前景。

▲图 | 不同微生物细胞工厂生产靛蓝（来源：上述论文）

同时，文章中也提到，这项工作仍然存在不足，例如缺乏代谢重建方面的工作。因此，在后续工作中，研究人员将通过代谢工程和 CRISPRi 策略，进一步改善靛蓝前体 L-谷氨酰胺的代谢流程，提高靛蓝的收率。此外，链霉菌培养的工业培养基也应进行优化，使其更有效地应用于靛蓝生产。

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