高彩霞团队开发基于Cas12a和环状RNA的引导编辑器，可同时编辑多达4个基因

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

引导编辑（Prime editing，PE） ，也称为先导编辑， 作为一种新型基因编辑工具，能够在不产生DNA双链断裂的情况下产生精确的DNA的替换、删除或插入，并已广泛应用于基础研究、农业育种和基因治疗等领域，并有望在今年进入人体临床试验。

PE系统由三部分组成，分别是nCas9、逆转录酶和pegRNA，pegRNA除了包含向导RNA（sgRNA）外，还包含逆转录酶模板（RTT）和引物结合位点（PBS），这是产生所需序列3′flap序列所必需的。

然而，目前PE系统还存在着一些挑战，系统太大导致的递送难题；较长的线性pegRNA不稳定且易被核酸酶降解。此外，它还存在对目标位点G/C-rich需求，以及脱靶性高的限制。

因此，如何进一步提升PE系统的精确性、消除对编辑位点的序列限制并降低递送难度，是基因组编辑领域亟待解决的重要技术难题。

2024年1月10日，中国科学院遗传与发育研究所高彩霞团队在Nature Biotechnology期刊发表了题为： Prime editing using CRISPR-Cas12a and circular RNAs in human cells 的研究论文 。

该研究使用了尺寸更小的Cas12a开发了四个环状RNA介导的引导编辑器（CPE）：niCPE、nuCPE、 sniCPE和snuCPE。相比基于Cas9的先导编辑系统， CPE系统优先识别G/C-rich基因组区域，并具有多重编辑能力。其中，基于核酸酶的nuCPE和snuCPE系统的编辑效率高达10.42%，而基于切口酶的niCPE和sniCPE系统在人类细胞中分别达到24.89%和40.75%的编辑效率。此外，该研究还显示，niCPE和sniCPE系统可同时编辑多达四个基因。

迄今为止，所有开发的高效引导编辑器都使用了CRISPR-Cas9蛋白，该蛋白源自II型原核CRISPR-Cas自适应免疫系统。还有许多其他原核核酸酶被鉴定，例如IsrB、IscB、TnpB，以及各种V型CRISPR-Cas蛋白（包括Cas12a）。

Cas12a（1227aa）相比Cas9（1368aa）具有多种优势：Cas12a可识别基因组中A/T-rich区域，能够编辑Cas9无法编辑的位点，而且，Cas12a的脱靶性更低，尺寸更小，可实现更高效地递送，并促进多基因编辑

但由于Cas12a具有切割pegRNA的特点，因此，传统的pegRNA并不适用于基于Cas12a的引导编辑器的开发。

在这项研究中，研究团队开发了使用Cas12a的环状RNA（circRNA）介导的引导编辑系统——CPE，包括切口酶依赖的CPE（niCPE）、核酸酶依赖的CPE（nuCPE）、分裂切口酶依赖的CPE（sniCPE）和分裂核酸酶依赖的CPE（snuCPE）。

实验结果显示，niCPE和sniCPE的编辑效率高于nuCPE和snuCPE，但nuCPE和snuCPE在人类细胞中也表现出令人满意的编辑效果。具体来说，niCPE和nuCPE在人类细胞系HEK293T中效率分别高达24.89%和10.42%，适合慢病毒等大分子量递送系统。sniCPE和snuCPE在HEK293T细胞中效率分别高达40.75%和3.19%，适合腺相关病毒（AAV）递送系统。除了HEK293T细胞以外，niCPE和sniCPE在HeLa、N2A、MCF7等细胞中也能有效产生精确的引导编辑。

此外，研究团队将靶向不同基因位点的CRISPR RNA（crRNA）串联在一起，置于环状RNA的表达框中，然后将RTT-PBS序列也串联到环状RNA表达框中，用CPE系统进行多重编辑。结果显示，niCPE和sniCPE可以进行双基因、三基因和四基因编辑，sniCPE在四个位点上的编辑效率为1.09%-15.08%。

研究团队还进一步检测了CPE系统的脱靶效应，结果表明CPE具有优良的特异性，几乎没有检测到脱靶效应。

总的来说，该研究开发了基于Cas12a的环状RNA介导的引导编辑（CPE）系统，提供了一种可选靶向范围、多基因编辑能力和更小的尺寸，这对于CPE系统的包装和递送具有优势。低脱靶效应、高编辑效率的CPE系统为利用各种核酸酶开发为新型引导编辑系统提供了通用范式，多类型的CPE系统在生物研究、疾病治疗和作物育种等多场景中将发挥巨潜力。

高彩霞研究组助理研究员梁荣洪、博士生贺子欣、齐禾生科生物科技有限公司Kevin Tianmeng Zhao博士为该论文的共同第一作者，高彩霞研究员为通讯作者。该研究得到科技创新2030-生物育种重大项目、国家重点研发计划和新基石科学基金的经费资助。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-02095-x