《CEJ》江南大学无锡医学院万涛：类胞外囊泡/水凝胶在炎症疾病中调节氧化应激！

近日，江南大学无锡医学院万涛教授等人报道了一种天然芦荟衍生的外泌体样纳米囊泡水凝胶(adenens)配方，用于治疗局部ros相关炎症性疾病，包括特应性皮炎(AD)和糖尿病伤口等，该项工作以“Nrf2 pathway activation with natural plant-derived exosome-like nanovesicle/hydrogel preparations for oxidative stress modulation in inflammation related diseases”为题发表在Chemical Engineering Journal 期刊上。文章链接：10.1016/j.cej.2023.148282。

图1. 治疗 AD 和皮肤伤口的治疗性 ADENH 示意图

Part.1/研究背景

众所周知，氧化应激升高与许多急性和慢性炎症性疾病的发生有关，包括心血管疾病、肝炎、肾炎、伤口愈合延迟和炎症性皮肤病。虽然正常水平的活性氧（ROS）在细胞信号传导中起着至关重要的作用，但过量的ROS会诱导高氧化应激，并导致细胞死亡，炎症反应中ROS过高可加重局部组织损伤，导致更严重的炎症。氧化还原转录因子Nrf2是抗氧化应激的重要调节因子之一，它调节抗氧化蛋白的表达，保护细胞免受氧化损伤，从而减少损伤和炎症。

植物来源的外泌体样纳米囊泡（PDENs）是一类前卫、无害、环保、强大且可行的纳米载体。已有大量研究证实PDENs在体内具有免疫调节、抗肿瘤、再生和抗炎的生物治疗作用，在疾病治疗和亚健康改善领域越来越受到关注。芦荟是大自然的神奇礼物，已被证明具有多种治疗作用，包括抗氧化，抗炎，抗菌和免疫调节。体外实验证明，芦荟衍生的外泌体样纳米囊泡(ADENs)对过氧化氢(H2O2)预处理的HaCaT细胞的氧化应激具有很强的保护作用。

Part.2/本文简介

在这项研究中，作者提出了一种天然植物来源的外泌体样纳米囊泡-水凝胶制剂的新概念，其中外泌体样纳米囊泡作为治疗成分从芦荟的外皮中分离出来，芦荟的内果肉被超声粉碎并浓缩形成水凝胶基质。然后将这两种组分混合以形成配方。从水凝胶中进一步释放外泌体样纳米囊泡可以通过Nrf2/HO-1途径增强皮肤中的抗氧化酶防御系统，并有效调节氧化态和抗氧化态之间的平衡，使特应性皮炎（AD）病变或糖尿病创面小鼠达到更有利的生理平衡。同时，由于芦荟水凝胶本身具有良好的保湿性能，可以加速炎症性皮肤病变和伤口部位天然屏障功能的修复。

Part.3/结果与讨论

作者首先制备了空白芦荟水凝胶和ADENHs，为了充分分析获得的ADENs，是在最佳条件下的，对ADENs的性质进行了表征，包括ADENs的粒径、形态和蛋白质分布等，结果如图2所示，接下来，作者还表征了ADENHs的流变性，包括剪切变形和粘弹性的测量。如图 2e 所示ADENHs 在 0.1 至 100 s 的剪切速率下表现出非牛顿流体剪切稀化特性。根据粘弹性测试结果，在0.01至10 Hz的频率和37 °C的频率下，其弹性模量（G'）始终大于其粘性模量（G''），表明水凝胶和ADENHs具有初级弹性特性（图2g）。综合考虑ADENHs的粘度、剪切变形和粘弹性，其适合局部应用，可局部涂抹在皮肤上，并且在皮肤上长期持续使用，可以为治疗皮肤病提供持久的效果。之后，还研究了ADENs在不同pH值下的稳定性，这些都结果都表明，当局部应用ADENHs用于糖尿病皮肤伤口愈合时，该制剂相对稳定。

为了进一步研究ADENHs对AD样症状的潜在影响，作者在体外评估了ADENHs的抗氧化特性。首先采用SOD比色法测定adenens的抗氧化活性。adenens的SOD活性呈剂量依赖性增加，当蛋白浓度为16 μg/mL时，SOD活性增加42%以上(图2i)。越来越多的证据表明，许多慢性和急性炎症性疾病与包括MDA在内的ROS产量增加密切相关，并且抑制了抗氧化酶活性，如GSH、SOD和 CAT.As 。并且水凝胶处理提供了持续释放ADENs的潜力，从而在较长时间内维持较高的局部药理学ADENs浓度。所以，ADENHs在表皮角质形成细胞中表现出优异的抗氧化特性。

图2. ADENHs的表征和ROS清除活性

接着，作者为了研究ADENHs在体内的生物安全性，研究了局部应用ADENHs对小鼠皮肤的刺激性，进行了标准的皮肤刺激性试验。实验中观察到小鼠皮肤的红斑和水肿（图3a-c）。根据标记标准，经过指定处理后，小鼠背部未发现红斑和水肿（图3d）。这些结果表明，ADENHs治疗对皮肤完整的小鼠皮肤没有刺激性。为了评估ADENHs对皮肤的免疫反应和毒性，在应用35天后使用H&E和免疫细胞的免疫荧光染色对背部皮肤进行组织学分析，以未经处理的小鼠皮肤作为对照（图3e），H&E染色显示治疗皮肤区域炎症细胞的浸润最小。然后，作者评估了TEWL的减少和皮肤水合水平的增加，这两者都是皮肤屏障功能的指标。如图3f-g所示。最值得注意的是，由于芦荟水凝胶具有良好的保湿性能，局部应用ADENHs或空白芦荟水凝胶会增加皮肤水合作用值并降低TEWL值，这将有利于改善皮肤状况。最后对小鼠实施安乐死，采集血液和主要器官进行血液分析。从体重变化、主要器官重量和主要器官切片的组织学分析可以看出，反复局部给药ADENHs后，未观察到全身毒性或对主要器官的负面影响（图4a-c）。此外，血液学和化学测量，也表明了ADENHs的生物安全性（图4d-f）。综上所述，ADENHs在体内具有优异的生物相容性和安全性。

图3. 指定治疗后皮肤组织的局部毒性评估

图4. 指定治疗后皮肤组织的全身毒性评估

之后，作者又对体内治疗效果进行了评估，首先评估了用ADENHs对DNCB诱导的AD小鼠模型的局部治疗（图5a）。图5g显示了整个实验期间每组小鼠背侧皮肤外观的粗略变化的代表性照片如图5b所示，DNCB的反复局部应用显着加重了皮炎的症状，Protopic®组和ADENHs组在整个实验期间皮炎严重程度评分均显著低于DNCB组。值得注意的是，Protopic®组和ADENHs组的皮炎严重程度评分没有差异。瘙痒的缓解是确定是否存在AD的关键指标。图5c显示，与AD模型组相比，Protopic®或ADENHs治疗可显著减少AD小鼠的抓挠行为，并且在抑制AD小鼠瘙痒方面最有效。在ADENHs治疗组中观察到穿刺活检样本的重量显着减轻（图5f），表明表皮增生和皮肤水肿显着减少。总之，这些结果表明，将ADENs掺入芦荟水凝胶中后，ADENHs可以有效抑制小鼠典型的AD样皮肤病变。然后，作者还评估了TEWL的降低和皮肤水合作用水平的增加，这两者都是皮肤屏障功能的指标。。这些发现表明，芦荟水凝胶可以帮助恢复AD皮肤病变的天然屏障功能。除了上述皮肤状况指标外，ADENHs治疗后皮肤弹性也有明显改善（图5j）。因此，可以得出结论，ADENHs可以对皮肤状态产生有利作用。

图 5. 通过 ADENH 缓解 DNCB 诱导的 AD

Nrf2的刺激有助于抗氧化酶的上调，这些酶可以保护皮肤病变免受氧化应激损伤。为了进一步评估 ADENH 的有效性，作者使用免疫印迹技术研究了 Nrf2 在核区和 HO-1 在 AD 皮肤病变中的定位（图6a）。研究结果表明，与对照组相比，仅使用 DNCB 治疗的组中 Nrf2 的核沉积显着降低（图 6b 和 d）。然而，相比之下，与单独使用 DNCB 的治疗组相比，ADENHs 处理导致 Nrf2 核沉积显着增加（图 6b-e）。接下来，使用相应的检测试剂盒测量血清和皮肤中抗氧化酶的水平，包括 SOD 和 CAT。如图 6i-l 所示，与正常组相比，用 DNCB 诱导的小鼠产生较低水平的 CAT 和 SOD。然而，与模型组相比，ADENHs处理显著提高了血清和皮肤匀浆中CAT和SOD的活性。综上所述，局部应用ADENHs可以通过增强抗氧化酶的防御系统并通过Nrf2/HO-1途径抑制炎症介质来预防DNCB诱导的AD。它可以有效地调节氧化态和抗氧化态之间的平衡，使DNCB诱导的小鼠达到更有利的生理平衡。

图 6. ADENHs 治疗对 DNCB 诱导的 AD 样皮肤病变中 Nrf2 信号通路的影响

组织学分析显示，仅DNCB治疗组有明显的皮肤病变，包括表皮增生、水肿和炎症细胞浸润（图7a）。与模型组相比，ADENHs治疗显著抑制了AD引起的表皮增厚，并进一步缓解了AD皮肤病变（图7b），表明ADENHs介导的治疗后皮肤水肿减少。此外，作者还使用了Masson染色来评估皮肤纤维化。如图 7e-f 所示，Masson 染色分析在 DNCB 诱导的 AD 部位表现出明显的皮肤纤维化，这反映在 AD 部位出现 Masson 阳性区域。在所有治疗组中，ADENHs和市售他克莫司软膏都可以使表皮/真皮区域的胶原蛋白正常化。总的来说，这些结果表明，ADENHs制剂足以有效保护动物免受AD样皮肤皮炎的侵害。

图 7. 指定治疗后小鼠AD样皮肤病变的组织学分析

最后，作者对ADENHs在体内的伤口愈合效果进行了评估，通过在I型糖尿病大鼠的背部创建1 cm的圆形伤口，建立了全层皮肤伤口模型（图8a）。监测每组的愈合进度并评估不同治疗的有效性（图 8b）。分析结果如图8所示，在整个愈合过程中，与其他组相比，ADENHs组表现出更快的伤口闭合速度。此外，H&E染色用于量化伤口愈合实验结束时再生的上皮厚度和肉芽组织厚度。如图8d-e所示，与对照组和空白凝胶组相比，ADENHs处理显著增加了再生上皮的厚度，与伤口区域结果一致。Masson的三色染色用于观察胶原蛋白沉积和血管生成（图8d和g）。染色表明，ADENHs组比其他组具有更大的胶原沉积和方向排列，表明ADENHs处理增强了细胞外基质重建和组织重塑。

图 8. ADENHs在糖尿病大鼠伤口愈合中的体内评估

为了进一步探索伤口愈合过程的生物学机制，分别通过CD31和IL-6的免疫荧光染色来评估血管生成和炎症。CD31染色图像和毛细血管密度定量表明，ADNEHs组在所有组中，在伤口床周围的皮下组织中显示出最大的新生血管形成（图9a-b）。通过IL-6免疫荧光染色，对照组IL-6在创床周围皮下组织中明显表达阳性。然而，IL-6 免疫荧光染色显示 ADENHs 组炎症或感染的证据很少，仅检测到少量 IL-6 分泌（图 9c-d）。总的来说，这些结果表明，ADENHs为促进伤口愈合提供了一种理想的治疗选择。

图 9. 免疫荧光染色分析伤口愈合过程的生物学机制

Part.4/总结

综上所述，作者提出了一种天然植物来源的外泌体样纳米囊泡水凝胶制剂的新概念。该配方不仅确保了芦荟资源的充分利用，而且在体外和体内都表现出优异的生物相容性。局部应用ADENHs后，凝胶中进一步释放的ADENs可以通过Nrf2/HO-1途径增强皮肤中抗氧化酶的防御系统，有效调节氧化状态和抗氧化状态之间的平衡，进一步为AD病变或糖尿病创面小鼠带来更有利的生理平衡环境。此外，由于空白芦荟水凝胶本身具有良好的保湿性能，它加速了炎症性皮肤病变和伤口部位天然屏障功能的天然屏障功能的修复。因此，这种ADENHs制剂有望成为治疗AD和糖尿病创面的潜在有效策略，也可以促进现代社会基于全药物植物成分的制剂的开发和进步。

https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.148282

来源：SL Zhou