突破性研究：类器官技术揭示纤维肝癌的新治疗靶点

本文来源：类器官学社

肝癌是全球范围内的主要死亡原因之一，而纤维板层癌(FLC)是一种罕见且具有挑战性的肝癌亚型。由于缺乏有效的治疗方法和模型，FLC的研究一直受到限制。

今天小学社带来了一篇关于FLC的最新研究，该研究使用CRISPR工程的人类肝细胞器官模型来研究FLC的分子机制和潜在治疗靶点，取得了重要进展。研究人员成功地重现了不同的FLC背景，并发现BAP1和PRKAR2A的联合缺失导致肝细胞向肝管/祖细胞样细胞的转分化，这为FLC的治疗提供了新的思路。快和小学社一起学习吧！

文章介绍

• 题目：纤维板层癌突变的类器官模型揭示了肝细胞通过BAP1和PRKAR2A协同缺失进行转分化

• 杂志：Nature Communications

• 影响因子：IF=16.6009

• 发表时间：2023年5月

#1

研究背景

Background

纤维板层癌(FLC)是一种致命的原发性肝癌，影响没有慢性肝病的年轻患者。由于缺乏有效的治疗方法和模型以及对纤维板层状癌肿瘤发生机制的分子理解有限，FLC的研究一直受到限制。

本研究使用CRISPR工程的人类肝细胞类器官，重建了不同的FLC背景，包括DNAJB1-PRKACA融合和BAP1和PRKAR2A的失活突变。研究比较了这些突变体类器官与原发性FLC肿瘤样本之间的相似性和差异性。

#2

研究思路

Methods

• 使用CRISPR工程的人类肝细胞类器官，重建不同的FLC突变体。
  

• 通过非同源端连接（NHEJ）介导的移码事件生成了PRKAR2A和BAP1基因的失活突变类器官。

• 使用特定的sgRNA和Cas9表达构建体转染，并使用潮霉素抗性盒进行筛选。

• 对所得的类器官系进行基因分型和扩增。

#3

研究结果

Results

1. 反映不同 FLC 突变背景的 CRISPR 工程人肝细胞类器官模型

研究人员利用组织来源的人胎儿肝细胞的类器官，采用CRISPR工程方法，成功地生成了带有不同FLC突变的克隆人肝细胞类器官系。他们通过双sgRNA技术成功地重新构建了内源性DNAJB1-PRKACA融合，并通过Sanger测序证实了其基因型。此外，还使用qPCR方法检测了染色体内缺失转化为嵌合融合的表达情况，并观察到DNAJB1-PRKACA染色体重排的效率很高，表明这些位点可能较容易发生基因组重排。

在后续实验中，研究人员产生了携带PRKAR2A和BAP1失活突变的类器官系，并生成了两个基因的单突变系。用PRKAR2A sgRNA、BAP1 sgRNA或两者同时转染单细胞分离的类器官，成功地产生了一组人肝细胞类细胞系，反映了与FLC不同遗传背景相关的内源性突变谱。实验结果表明，DNAJB1-PRKACAfus、PRKAR2AKO、BAP1KO和BAP1KO;PRKAR2AKO类器官都是有活力的，并且可以以与野生型类器官相似的方式扩增，但在不同突变培养中观察到了不同程度的表型差异（图1）。

图1

2. FLC突变可引起不同程度的肝细胞表型改变

通过组织学检查，发现BAP1KO和BAP1KO;PRKAR2AKO类器官中出现了细胞发育不良的多重特征。表明引入FLC突变后，人肝细胞类器官出现了不同程度的细胞和形态学改变，其中最严重的改变与BAP1和PRKAR2A的缺失有关。通过MKI67阳性定量和基于ATP活力的测定，发现BAP1KO和BAP1KO;PRKAR2AKO突变体比野生型细胞具有生长优势，同时BAP1KO单突变体表现出凋亡细胞增加的趋势。在PKA信号相关基因突变方面，DNAJB1-PRKACAfus突变体和PRKAR2AKO基因单突变体表现出更高的pCREB水平。在BAP1KO;PRKAR2AKO类器官中，诱导后的pCREB水平最高，突出了这两个突变在驱动PKA激活方面的合作。（图2）

图2

3. 转录组学分析揭示了肝细胞中不同FLC突变引起的不同分子改变，且工程FLC突变类器官模型与FLC肿瘤具有转录组相似性

通过PCA分析发现突变体分成两个亚群，其中一个亚组包含单个PKA突变驱动的转录组特征，另一个亚组通过BAP1突变确定。通过差异基因表达分析比较与野生型类器官的分子变化，发现BAP1KO;PRKAR2AKO的转录组变化最大。通过对突变体与野生型类器官中基因表达的比较，发现单蛋白激酶A (PKA)相关突变体与BAP1相关突变体因基因表达趋势不同而分离。对差异表达基因进行分层聚类，发现5个不同的基因簇。簇3包括参与药物代谢、胆固醇生物合成、PPAR信号传导和蛋白质翻译；簇4主要参与氨基酸分解代谢、脂质代谢、糖酵解和甘油三酯生物合成；簇5中上调最多的基因与Wnt通路相关，簇1中的基因与凋亡/应激反应信号通路、TP53和TGFβ信号通路有关，而簇2中的基因涉及细胞外基质组织和细胞连接成分以及参与粘蛋白分泌的基因。

研究继续使用人工类器官模型和FLC肿瘤组织的转录组数据进行比较，并使用基因集富集分析和分层聚类分析进行了验证，发现突变类器官模型和相应FLC亚型的转录组具有相似性，许多标记物与肿瘤组织中已知突变相关。但是，存在转录组异质性，因此不是所有表达变化都能在模型中找到。（图2、3）

图3

4. FLC突变重塑肝细胞的细胞特性

转录因子控制肝脏特异性功能和细胞特性，FLC突变导致肝细胞命运发生变化，表达肝细胞标志物下降，导管/祖细胞标志物上调，BAP1和PRKAR2A同时失活会导致最剧烈的细胞命运转变。这些突变类器官及其在原发性FLC肿瘤组织中的表征与之前定义的肝细胞和导管/祖细胞的细胞特性特征一致。 免疫荧光染色表明，BAP1KO;PRKAR2AKO类器官中典型的肝细胞标志物ALB的蛋白表达降低，而KRT7和KRT19则呈现阳性表达，双突变体是唯一表达EMA (MUC1)的模型。因此，FLC突变会影响肝细胞的特异功能和细胞特性，增加导管/祖细胞样表型的几率，并在一定程度上表现出异质性。（图4）

图4

5. 双BAP1和PRKAR2A突变型肝细胞在刺激肝导管细胞增殖的环境中选择性生长，cAMP的激活驱动肝细胞生长为导管样细胞

研究发现，肝脏的上皮细胞可以培养为两种类器官：EpCAM+细胞产生的肝导管类器官和ALB+肝细胞类器官，且每种类器官都需要各自的培养基以维持其扩张生长。研究人员发现，BAP1KO和PRKAR2AKO突变之间的合作能使人类肝细胞获得细胞塑性基态，从而响应不同的生长信号，促进肝导管细胞扩张，而野生型肝细胞和其他突变体在导管培养基中生长受阻。

进一步研究发现，forskolin选择性地促进了双突变类器官的生长，改善了BAP1KO和PRKAR2AKO突变体的长期生长，可以产生多囊性类器官。此外，野生型类器官在添加forskolin的培养基中的肝细胞标志物表达不受影响，而双突变体表现出更多的增殖标记物和导管标记物。（图2-5）

图5

6. BAP1突变在导管环境中启动细胞周期的进程，但需要PRKAR2A缺失来驳回有丝分裂阻滞

研究发现BAP1和PRKAR2A突变在同时存在时可能有协同作用，允许最初的靶向肝细胞在导管环境中增殖。研究人员使用基于piggybac的FUCCI质粒系统转染类器官并进行实时成像，发现 BAP1 肝细胞在导管环境中显示出细胞周期阻滞的迹象，与野生型肝细胞的行为形成鲜明对比。而 PRKAR2A 的失活则可以使 BAP1 突变的肝细胞进入 S 期并最终分裂，在导管环境中实现增殖。（图6）

图6

7. 双BAP1和PRKAR2A突变的肝细胞具有干性和转分化能力

研究分析了在导管和肝培养基中培养的野生型和BAP1KO;PRKAR2AKO肝细胞类器官的全转录组，发现导管环境对肝细胞成熟相关基因有诱导作用但对增殖和代谢相关基因有抑制作用，这与双突变类器官的反应相反。BAP1KO;PRKAR2AKO类器官在导管培养基中的长期培养表现出干细胞标记物和癌症相关标记的高表达，并且与FLC PDX组织和BTSC高度相关。表明，BAP1和PRKAR2A的同时缺失将驱动人肝细胞转分化为导管/祖细胞样的癌症干细胞。（图7）

图7

小结

本研究结果表明，使用CRISPR工程的人类肝细胞类器官模型可以成功地重现不同的FLC背景，并探索FLC的分子机制和潜在治疗靶点。研究人员发现，所有FLC突变都导致肝细胞去分化，但只有BAP1和PRKAR2A的联合缺失导致肝细胞向肝管/祖细胞样细胞的转分化。这一发现为FLC的治疗提供了新的思路。此外，该研究还展示了CRISPR工程的人类肝细胞器官模型在研究肝癌等疾病方面的潜力。这项研究为我们更好地理解FLC的发病机制和开发新的治疗方法提供了重要的参考。

参考文献

Rüland L, Andreatta F, Massalini S, Chuva de Sousa Lopes S, Clevers H, Hendriks D, Artegiani B. Organoid models of fibrolamellar carcinoma mutations reveal hepatocyte transdifferentiation through cooperative BAP1 and PRKAR2A loss. Nat Commun. 2023 May 3;14(1):2377. doi: 10.1038/s41467-023-37951-6. PMID: 37137901; PMCID: PMC10156813.

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本文来源：类器官学社