神经内分泌肿瘤患者来源类器官样本的药物依赖性和肿瘤进化分析

撰文 | 染色体

神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasms，NENs）通常表现出神经内分泌分化特征，最常见于肺部和胃肠胰（GEP）系统。NENs分为神经内分泌瘤（neuroendocrine tumors，NETs）和神经内分泌癌（neuroendocrine carcinomas，NECs)【1】。NECs进一步细分为小细胞NECs和大细胞NECs（large cell neuroendocrine carcinoma，LCNECs），其中小细胞NECs主要见于肺部，而LCNECs更常见于GEP系统。尽管小细胞NECs因肺小细胞肺癌（SCLC）得到了广泛的研究，但LCNEC的治疗指南仍不明确。NECs通常具有较差的分化和预后，而NETs则分化良好且预后较好。目前对NECs和临床侵袭性NETs没有明确的治疗标准【2】。由于缺乏临床前模型，LCNEC和NET的研究进展受到阻碍【3】。

近日，来自荷兰Hubrecht研究所的Hans Clevers，与来自法国IARC/WHO机构罕见癌症基因组学团队的Lynnette Fernández-Cuesta共同在Cancer Cell期刊发表题为Druggable growth dependencies and tumor evolution analysis in patient-derived organoids of neuroendocrine neoplasms from multiple body sites（多个身体部位神经内分泌肿瘤患者来源类器官的可成药生长依赖性和肿瘤进化分析）的文章。研究人员通过建立来自肺NETs和LCNEC患者来源的肿瘤类器官(patient-derived tumor organoids，PDTOs)，成功保留了原发肿瘤的特征。研究发现ASCL1可作为LCNEC对BCL2抑制剂治疗反应的标志物。此外，肺NET PDTOs对表皮生长因子EGF表现出依赖性，大约有50%的肺NETs表达EGFR。该研究确定了肺NETs的潜在治疗靶点，并强调了PDTOs模型在研究中的实用性。

PDTOs是一种能够长期扩增的肿瘤细胞三维培养模式，可代表原发肿瘤组织的特征【4】。研究人员利用PDTOs建立模型，研究不同类型NENs的生物学特性和潜在治疗靶点。他们发现，肺NETs存在不同的分子亚型，某些肺NETs对生长因子有依赖性，这些发现为NENs的治疗提供了新的思路。

PDTOs 培养模型的构建

首先，研究人员从接受手术或活检的NET或LCNEC患者中获得组织样本，经过处理和培养，成功建立了多个肺NETs和LCNEC的PDTOs模型。这些PDTOs表现出长期的生长能力，并呈现出不同的形态特征。研究表明，使用少量患者样本中建立LCNEC PDTOs是可行的。进一步研究显示，PDTO模型能够准确地重现与原发肿瘤相匹配的组织学特征，并通过神经内分泌标记物染色证实了其神经内分泌起源。将LCNEC PDTOs移植到小鼠体内，验证了其具有成瘤性。此外，PDTOs模型的增殖指数与原发肿瘤中的相似，这是低级别NET的一个显著特征。LCNEC和低级别肺NETs （low-grade pulmonary NETs，LNET）PDTOs模型显示不同的体外增殖模式，而小肠神经内分泌肿瘤（SINET）的PDTOs模型由于不能进行长期体外传代而无法分析其增殖情况。总体而言，PDTOs模型的培养并未改变NEN亚型肿瘤的生长速率。

NEN PDTOs保持原发肿瘤的基因特征和演化过程

接下来，研究人员评估了NEN PDTOs是否能够保持其原发肿瘤的基因表达谱。结果显示，大多数NEN PDTOs的神经内分泌标记物表达水平与原发肿瘤相似，而少数LNETs PDTOs显示出较低的神经内分泌标记物表达。通过对PDTOs的肿瘤纯度进行评估，发现一些PDTOs同时含有健康细胞和肿瘤细胞，而另一些则主要包含肿瘤细胞。转录组分析表明，高纯度PDTOs与原发肿瘤在分子特征上相似。此外，研究还发现了能够区分PDTOs和原发肿瘤的标记物，其中大部分与免疫相关。这些研究结果表明PDTOs包含原发肿瘤的肿瘤和上皮组分，但不包括基质成分。基因组图谱分析结果显示，NEN PDTOs在基因组水平上保留了原发肿瘤的特征。研究人员发现PDTOs与原发肿瘤具有相似的突变负荷、突变基因谱、拷贝数变化和结构变异模式。PDTOs在基因组水平上能够重现原发肿瘤的克隆和亚克隆变异比例，并保留了主要的亚克隆。此外，研究还发现PDTOs中出现的突变不仅是由原发肿瘤中活跃的相同突变过程产生的，还反映了最新变异来源的变化。研究表明，即使在经过多次传代的PDTOs中，遗传多样性水平仍类似于原发肿瘤中观察到的水平，表明PDTOs能够全面保留其原发肿瘤中的演化过程。这些结果证实了NEN PDTOs的可靠性，可用于肿瘤基因组特征研究，并为个体化治疗和药物筛选提供参考。

NEN PDTOs助力药物测试和肿瘤治疗

研究人员使用PDTOs来评估NENs对药物治疗的敏感性以及预测治疗反应的能力。研究发现，不同的PDTOs对紫杉醇类药物和mTOR抑制剂的反应存在差异。BRAF突变的病例对BRAF和MEK抑制剂表现出高度敏感性。根据ASCL1和NEUROD1的表达水平，研究人员试图寻找针对ASCL1高表达LCNEC肿瘤的潜在治疗方案。实验结果显示，ASCL1高表达的细胞对BCL2抑制剂Navitoclax显示敏感性，而ASCL1低表达的细胞则表现出耐药性，这表明ASCL1可能成为LCNEC患者对BCL2抑制剂治疗反应的潜在生物标志物。此外，在培养基优化阶段实验中，研究人员发现烟酰胺对NEN PDTOs的生长具有抑制作用，这表明NEN对影响烟酰胺向NAD+转化的药物是敏感的。实验结果还显示，当在NEN PDTO中使用烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）抑制剂FK866时，存在潜在的治疗反应。总之，这些结果表明PDTO在临床前药物筛选中具有应用价值，可以识别出潜在的治疗靶点。

为了确定NEN PDTOs的依赖性，研究人员测试了常用生长因子（如EGF、FGF7和FGF10）对其生长的影响。结果表明，肺NET PDTOs对EGF的依赖性较高，添加含有EGF的生长基质可以促进PDTOs的生长。对于LNET PDTOs，研究结果显示添加EGF可以改善某些LNET PDTOs的增殖能力，而缺乏EGF会影响它们的生长。此外，肺部NET PDTOs在不含EGF的基质中会停止生长，并且无法超过3代。部分肺NETs还显示了对EGFR的依赖性，有近一半的肺NETs亚群表达膜EGFR。药物测试显示，如预期一样，某些NET PDTOs对EGFR抑制剂敏感。另外，研究人员还发现一些PDTOs对MEK抑制剂敏感，表明MAPK信号传导对部分NENs的重要性。这些数据支持部分肺NETs依赖于EGF生长因子信号传导，以及靶向EGFR或MAPK治疗肺NETs的潜力。

综上所述，该研究建立了一个包含不同恶性程度的NETs PDTO生物库，其中包括低级别NET和高级别LCNEC模型。研究人员发现部分肺NETs对EGF的依赖性，这对于进一步了解NENs的肿瘤发生和治疗具有重要意义。

https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.11.007

制版人：十一

参考文献

1. Rindi, G., Mete, O., Uccella, S., Basturk, O., La Rosa, S., Brosens, L.A.A., Ezzat, S., de Herder, W.W., Klimstra, D.S., Papotti, M., and Asa, S.L. (2022). Overview of the 2022 WHO Classification of Neuroendocrine Neoplasms.Endocr. Pathol.33, 115-154.

2. Corbett, V., Arnold, S., Anthony, L., and Chauhan, A. (2021). Management of Large Cell Neuroendocrine Carcinoma.Front. Oncol.11, 653162.

3. Lorz, C., Oteo, M., and Santos, M. (2020). Neuroendocrine Lung Cancer Mouse Models: An Overview.Cancers13, 14.

4. Sachs, N., and Clevers, H. (2014). Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes.Curr. Opin. Genet. Dev.24, 68-73.