Nature系列综述：罗伯特·兰格概述黏膜疫苗设计中工程材料的作用

编译丨Vergil

来源丨RNAScript

罗伯特·兰格（Robert Langer）是麻省理工学院（MIT）享有最高荣誉的教授之一，并参与创建了40多家成功的生物技术公司，其中就包括成功研发出首个mRNA疫苗的Moderna公司。

2023年12月18日，Robert Langer等人在Nature旗下综述期刊Nature Reviews Materials上发表了题为： The role of engineered materials in mucosal vaccination strategies 的综述论文。

该综述 按给药途径分类，概述了当前黏膜疫苗的材料设计在克服现有给药挑战上的重要性。

据报道，有超过90%的病原体通过黏膜部位进入人体。黏膜病原体在黏膜组织中复制并通过接触黏膜分泌物传播。因此，设计直接在黏膜部位产生保护的疫苗接种策略有助于更好地预防感染、限制疾病严重程度和减少流行病传播，能够在病原体进入点直接靶向和中和病原体。

消化道（包括口腔、食道、胃、小肠、结肠、直肠）具有较大的表面积，是所有黏膜组织中被研究最多的组织。另一方面，呼吸道（鼻腔、气管、肺）是呼吸道感染的首要组织。虽然与消化道和呼吸道相比，女性生殖道（子宫、阴道）的表面积较小，但却是性传播疾病常见的感染部位。下表总结了常见黏膜感染病原体及其感染途径（呼吸道、胃肠道或泌尿生殖道）、死亡和感染人数以及目前的疫苗覆盖率。

表1. 常见黏膜感染疾病及防控现状

然而，黏膜组织的许多特征对疫苗递送提出了挑战。除了物理屏障外，黏膜具有免疫抑制微环境、可变pH和多样化的微生物群，能够快速清除、降解外源性物质。因此，黏膜疫苗无论免疫原性成分如何，均需要防止被表层黏膜组织降解，抵抗机械清除并穿透黏液层，直到疫苗到达靶点位置并被适当的细胞群吸收，继而由免疫原性抗原呈递细胞（APC）呈递激活免疫。目前已开发多种功能迥异的生物材料，能够在防止免疫原性成分降解、实现特异性定位、靶向细胞群、pH值响应释放和动力学以及实现佐剂效果等方面发挥独特作用，使得不同功能的生物工程材料成为了改进黏膜疫苗的理想平台。

黏膜免疫最突出的指标之一是黏膜中免疫球蛋白A（IgA）的产生。然而，全身途径产生的IgA不会转运到黏膜分泌物中。一些疫苗可能会引起可测量的血清 IgA，但可能不会同时引起黏膜IgA的产生。对病原体的有效保护需要全身和黏膜免疫反应的协调参与，同时产生免疫球蛋白G （IgG） 和IgA抗体。因此本综述中将IgA和IgG的产生作为疫苗有效性的衡量标准。

了解黏膜组织结构和特性

为了配制有效的黏膜疫苗，了解黏膜组织的结构和特性至关重要。黏膜组织是人体与周围环境之间的屏障，可分为I型和II型 （图1a,b） 。

I型黏膜包括胃肠道、呼吸道和女性上生殖道的组织。I型黏膜组织内衬有一层柱状上皮细胞，除了通过新生儿Fc受体（FcRn）转运IgG外，还表达聚合物免疫球蛋白受体（pIgR）通过上皮转运IgA进入固有层。 分泌型IgA （sIgA） 通过pIgR-IgA复合物的裂解释放到I型黏膜的管腔中。 黏膜相关淋巴组织（ MALT） 是继发性淋巴组织，主要存在于I型黏膜组织中，其中微折 （M） 细胞从黏膜表面吸收抗原从而激活幼稚T细胞和B细胞。

II型包括角膜、口腔、食道和女性生殖系统的组织。II型黏膜组织内衬为分层鳞状上皮细胞，仅表达FcRn转运IgG。

图1. I型和II型黏膜组织以及黏膜组织IgA分布

不同给药途径接种疫苗后黏膜组织IgA分布如图1c所示。通常IgA保护以一种固定模式表现：其中直接接触疫苗的黏膜处反应最强，其次是在邻近黏膜处的反应。有研究发现，在远端黏膜组织中可以诱导免疫反应，例如鼻内给药后阴道和直肠组织中IgA的产生。远端黏膜免疫的强度通过不同级别的阴影来描述（阴影越深表示响应越强）。

无论具有何种表面形态，黏膜组织都有共性的结构划分，可以细分为三个不同的结构层：黏液层、上皮层和固有层，固有层是位于上皮层下方的组织层，由基底膜隔开。尽管多层黏膜组织结构可以防止病原体入侵，但它们也是疫苗设计中必须克服的障碍。此外，黏液的运动和脱落，得益于呼吸道中纤毛上皮的摆动或胃肠道的蠕动，影响疫苗制剂的扩散。因此，为了开发有效刺激黏膜组织保护性免疫反应的黏膜疫苗，必须了解黏膜组织的特性。

黏液层由I型杯状细胞 （Goblet Cell） 和II型黏膜组织中的邻近腺体分泌的水合黏蛋白网络组成，充当第一黏膜屏障限制病原体进入上皮层。黏液层的厚度在不同的黏膜组织中差异很大，在同一组织也各不相同。因此在设计黏膜疫苗时，应考虑给药部位的黏液层厚度，以及对疫苗进入上皮层的影响。

上皮层作为第二层黏膜表面屏障，厚度范围为100至800μm。I型黏膜组织的上皮层由简单的柱状上皮和分泌黏蛋白的杯状细胞组成。然而，II型黏膜组织中的上皮层由分层鳞状上皮细胞和多层角质形成细胞组成。与I型组织中的单细胞层相比，II型组织中的这种多层细胞结构提供了更好的机械应力保护。这种结构差异表明，疫苗制剂需要更深入地渗透到II型黏膜组织中，才能穿过上皮层到达固有层以激活免疫细胞。

固有层包含大量的树突状细胞、巨噬细胞以及复杂的血液和淋巴管系统网络。破坏上皮细胞的抗原可以被树突状细胞吸收，并通过收集淋巴管带到引流淋巴结。黏膜相关淋巴组织 （MALT） 包含相当一部分CD8 T细胞、γδ T细胞和抗原采样微折 （M） 细胞，它们跨越覆盖B细胞和T细胞滤泡的上皮细胞到固有层。淋巴细胞活化在MALT中通过M细胞取样和腔内抗原的转胞吞作用发生，然后由树突状细胞呈递给MALT中的幼稚淋巴细胞。MALT可进一步细分为肠道相关淋巴组织 （包括肠Peyer斑块和孤立的淋巴滤泡） 、鼻相关淋巴组织 （包括人类的扁桃体） 和诱导型支气管相关淋巴组织。黏膜表面具有一定丰度的经历抗原的组织驻留淋巴细胞，为对抗黏膜病原体提供了强大的局部保护。

黏膜给药途径与材料策略

黏膜疫苗递送具有多种材料设计和装置，例如胶囊、粉末、喷雾剂、乳膏、液体（乳剂、溶液和混悬液）和微针贴片等（如图2）。此外，根据疫苗免疫原性成分（即DNA、mRNA、蛋白质、灭活病毒等）的化学性质，需要对疫苗递送载体的理化特性进行定制，以帮助有效成分的封装和递送。

图2. 常见黏膜疫苗接种途径和递送材料

口腔（舌下或颊内侧）

口腔黏膜中存在丰富的免疫细胞，利用口腔黏膜可以在口服疫苗诱发黏膜免疫反应的同时，绕过与胃肠道疫苗接种相关的并发症。这一途径需要克服普遍较厚的黏液屏障和紧密的上皮连接，并防止天然口腔菌群对疫苗成分的破坏，通常可通过设计专门的机械式平台实现黏膜穿透和递送。

有报道开发了一种颊无针微射流系统MucoJet，用于卵清蛋白抗原的上皮下递送 （图3） 。 与在颊区局部使用滴管递送抗原相比，该途径显示口腔黏膜组织IgA和血清IgG水平的显著升高。 该系统装置还可使用冻干抗原。 在猕猴模型的HIV疫苗接种实验中，产生了与皮下疫苗接种相当的IgG滴度，在直肠、阴道、唾液中的IgA滴度则更强。

图3. 颊无针微射流系统MucoJet示意图

此外，还有团队设计了可在颊黏膜表面持续释放的多层纳米纤维粘附膜平台[3]，将PLGA-PEG纳米颗粒缓慢释放到口腔黏膜中 (图4) 。 这种纳米纤维储层的极大表面积允许高水平的纳米颗粒负载，使得纳米颗粒可以可逆地吸附在纳米纤维的表面，也可以沉积在纳米纤维之间的孔隙中。 该团队已在猪模型中证明了舌下黏膜免疫的可行性。

图4. 多层纳米纤维黏附膜示意图

口腔（胃肠道）

胃肠道由于酸性环境和酶的存在会即时降解以可溶性形式递送的抗原表位，不如呼吸道等其他黏膜表面那样有利于强大的免疫激活。同时，胃肠道的免疫耐受会阻碍疫苗的免疫反应，肠道菌群的干扰会影响疫苗的稳定性和有效性。通过胃肠道内容物稀释疫苗和通过蠕动运动消除疫苗会进一步导致该问题。因此，通过胃肠道途径产生免疫反应需要更高的剂量，但也由此产生了安全性的问题。

脂质载体

阳离子脂质体因其佐剂作用而被研究为有效的胃肠道疫苗载体。 封装编码结核分枝杆菌蛋白的DNA疫苗的阳离子脂质体诱导小鼠肠道上皮、M细胞、树突状细胞和Peyer斑块中抗原的表达。 然而，基于脂质的平台在口服给药方面存在一些局限性，特别是其结构对胃肠道中胃酸、胆盐和胰脂肪酶的脆弱性。此外，传统的脂质体在肠上皮细胞的通透性较差。

与聚合物偶联、聚合物肠溶衣和脂质组合物的改变等改性方法已被用于解决胃肠道递送稳定性和渗透性问题。 例如可在脂质双层中掺入胆汁盐，以提高胃肠道中的稳定性。

天然聚合物载体

与可溶性抗原相比，由天然聚合物（包括淀粉、透明质酸、卡波波尔、海藻酸盐、β葡聚糖、壳聚糖和凝集素） 组成的颗粒包裹抗原，可以增加黏膜部位的停留时间来增强免疫反应。 有研究采用含有乙型肝炎重组蛋白和CpG佐剂的海藻酸盐包被壳聚糖的NPs，在大鼠模型中口服递送，观察到被有效地吸收到Peyer斑块中，并检测到血清高特异性IgG滴度和肠道分泌的IgA。 然而，这类植物提取物的低产量、复杂的下游加工、不可预测的蛋白质产量和有限的监管框架限制了其应用。

合成聚合物载体

PLGA具有生物降解性、生物相容性和控释能力，是口服抗原递送系统中研究最多的聚合物。 基于PLGA的配方的优势在于能够通过改变分子量、聚乳酸 （PLA） 与聚乙醇酸 （PGA） 单体的比例以及官能团末端基团来调整其封装曲线和释放动力学，以适应所需的应用场景。使用PLGA颗粒递送抗原的主要挑战之一是聚合物水解时会形成酸性副产物，需要制定有效的聚合物稳定策略。

无机载体

与软质有机材料相比，无机NPs为酸性胃环境中的抗原递送提供了稳定且具有刚性的框架，可以防止聚合物NP常见的抗原过早释放问题。有研究采用壳聚糖官能化的金纳米颗粒与佐剂一起口服递送破伤风类毒素抗原，在三剂次口服免疫后在小鼠粪便和肠道灌洗液中检测到了增强的破伤风类毒素特异性IgA。

病原体仿生载体

病毒载体经过改造，以模拟自然感染的方式呈递表达靶抗原的遗传物质 （DNA或mRNA） ，是突破黏膜屏障并在黏膜进入部位诱导强烈免疫反应的最有效平台之一。 Vaxart公司开发了一种温稳定的口服肠溶片剂，含有无复制能力的重组腺病毒5型 （Ad5） 载体疫苗，采用编码所选病原体特异性蛋白抗原的两个有效载荷基因以及将一个双链RNA （dsRNA） 作为佐剂搭载在同一病毒载体上在临床试验中，这种携带者已被证明可以诱导针对多种肠道和呼吸道病原体的强效黏膜和全身免疫，包括诺如病毒 （临床1期） [NCT02868073]，H5N1 （临床1期） [NCT01335347]和SARS-CoV-2 （临床1期） [NCT04563702]。

病毒样颗粒是另一种有希望实现有效口服抗原递送的候选载体。 Oravax是一种基于病毒样颗粒的三联抗原口服疫苗，封装在保护性胶囊中，靶向三种SARS-CoV-2病毒表面蛋白。 该平台在临床前研究中被证明在触发IgG和IgA反应方面是安全有效的，即将进入临床1/2期试验。

鼻腔

鼻黏膜是空气传播病原体必须通过的第一道屏障。因此，在空气传播病原体的主要进入部位诱导强大的局部免疫反应是对抗感染的关键。鼻内给药涉及将疫苗直接引入鼻腔，靶向上呼吸道，包括鼻腔喷雾、滴剂和吸入式粉末。然而，鼻腔纤毛的快速清除会导致疫苗的效力减弱。鼻腔疫苗是公共卫生领域的宝贵工具，具有易于管理、无针疫苗接种以及诱导局部和全身免疫反应的能力等优点。

例如，壳聚糖作为具有免疫刺激活性的载体和佐剂，除用作口服递送工具外，在鼻腔给药后也同样诱导了呼吸道中增强的细胞和体液免疫反应，表现为血清中的IgG滴度增加，组织表面IgA抗体增强以及干扰素γ细胞因子的分泌增加。

此外，有多项研究证实了鼻内给药相较于传统肌内给药的提供了更好的黏膜保护。一项采用鼻内递送 SARS-CoV-2 刺突蛋白和受体结合域的黑猩猩腺病毒载体疫苗在小鼠和恒河猴模型体内诱导了更高水平的中和抗体，促进了全身和黏膜IgA以及CD8 T细胞反应，提供了比肌肉注射更好的保护

肺部

肺部疫苗与鼻腔疫苗一样都是非侵入性的。然而需要区分，鼻腔疫苗针对的是上呼吸道，而肺部免疫则针对下呼吸道，包括气管、支气管和肺部。为了靶向该区域并在肺部引发更强的免疫反应，肺部疫苗通常以喷雾或雾化形式给药。肺部疫苗的部位特异性功效直接取决于雾化颗粒的特性，例如载体的大小和表面电荷。较大尺寸的颗粒倾向于停留在上呼吸道的黏膜组织上，而较小的颗粒更有可能到达下呼吸道。此外，由于呼吸道黏膜内壁带负电荷，带正电荷的载体黏膜黏附性更强，更容易停留在上呼吸道。带负电荷的载体则因电荷排斥从而增加到达下呼吸道的机会。

在使用PLA或PLGA NP对粒径和疏水性对抗原肺部递送的多因素和相互依赖影响的对照分析中，更大（>500 nm）、更疏水的颗粒能够被大鼠肺泡巨噬细胞更有效地内化，因此在接种乙型肝炎表面抗原（HBsAg）后诱导了更高的血清IgG、黏膜分泌IgA和内源性细胞因子水平。

直肠、阴道、子宫

黏膜疫苗也可以通过直肠内、阴道内或子宫内途径递送。

直肠黏膜富含血管，表面积相对较大，可以有效吸收疫苗抗原。然而，直肠黏膜中多样化的微生物群影响疫苗的效力和稳定性。在共生菌存在的情况下保持稳定性在疫苗设计中至关重要。

与直肠黏膜类似，阴道黏膜具有高度血管化并含有专门的免疫细胞，为有效摄取抗原和免疫刺激提供了机会。阴道pH值呈酸性，会影响疫苗的稳定性。此外，月经周期中的荷尔蒙变化会影响阴道黏膜的通透性和免疫环境。阴道疫苗应克服这些挑战，以有效诱导免疫反应。

子宫黏膜会随着荷尔蒙的波动而发生周期性变化，个体之间子宫解剖结构的差异会影响疫苗的吸收和免疫反应。应该注意的是，子宫内给药需要特别注意安全性，以避免对生殖系统组织造成潜在伤害，并确保没有疫苗成分对生育产生不利影响。

非黏膜给药途径

少数平台通过经皮、皮下和肌肉注射给药途径诱导黏膜免疫。非黏膜途径疫苗接种不能直接暴露于黏膜组织，在诱导分泌性IgA产生方面效果较差，不会产生黏膜记忆细胞，也不会在病原体进入部位提供保护。由于黏膜免疫激活往往需要特定刺激信号，因此，当使用非黏膜途径时，需要佐剂来增强免疫反应。这类疫苗递送系统的关键设计目标是能够提供佐剂，以增加下游黏膜免疫的免疫刺激反应。

展望

尽管黏膜疫苗有了实质性的发展，但目前只有少数疫苗（其中大部分是口服疫苗）获得了FDA的批准。黏膜疫苗的开发在递送、接种、免疫原性和安全性等方面面临独特的挑战，需要根据不同给药途径或接种黏膜部位，以及不同黏膜组织的性质进行独特设计。

其中，疫苗载体的理化性质（包括尺寸、形状、表面电荷和材料选择）是克服这些挑战和确定生物相容性、降解率以及疫苗稳定性和释放动力学的关键。此外，佐剂也是黏膜疫苗设计中的关键参数，有助于刺激更强大的免疫反应，激活先天免疫途径（通过触发细胞因子和趋化因子的释放），促进APC对抗原的摄取，增强黏膜分泌IgA的产生，稳定疫苗的免疫原性成分，减少疫苗剂量所需的抗原，并通过产生免疫记忆细胞以提供持久的免疫力。

https://www.nature.com/articles/s41578-023-00625-2