光合作用相关基因的系统性鉴定和表征

撰文 | 染色体

在光合作用的真核生物中，叶绿体类囊体膜上的一系列蛋白质复合物构成了光合作用装置，它们能够利用光能产生NADPH、ATP以及其他细胞能量物质【1】。这些NADPH和ATP进一步驱动许多生物途径，特别是通过卡尔文-本森-巴沙姆（Calvin-Benson-Bassham）代谢循环将CO2转化为糖的代谢途径【2】。光合复合物的组装和活性调节需要通过细胞核来进行控制，涉及到细胞核和叶绿体编码的数百个基因。在植物和绿藻中，这种协调通常包括不同的调节机制。其中包括核编码蛋白质对叶绿体表达基因的转录后调控，叶绿体表达亚基的转录调控，以及蛋白酶介导的未组装亚基的降解。尽管对光合作用及其调控已经进行了70年的研究，但系统发生学研究显示仍有数百个参与光合作用的基因有待鉴定和表征。实际上，关于GreenCut2基因（一组在绿色光合作用真核生物中共有597个成员的保守基因）约有一半的基因功能尚未被了解【3】。

近日，来自美国普林斯顿大学分子生物系的Martin C. Jonikas团队在Cell期刊发表题为Systematic identification and characterization of genes in the regulation and biogenesis of photosynthetic machinery（光合机制调控和生物合成基因的系统性鉴定和表征）的文章。研究人员以模式真核藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作为研究对象，利用高通量遗传学的方法鉴定了与光合作用相关的70个基因，并通过研究基因缺失突变株对这些基因的功能进行了表征。结果发现，至少有7种蛋白质在光合作用的生物合成和调控中起着重要作用。这项研究为我们更加系统地理解光合作用提供了基础。

莱茵衣藻是一种模式真核藻类，具有高通量和生理优势，有利于鉴定和表征光合作用的必需基因【4】。在过去的十年中，通过对莱茵衣藻突变体库进行筛选，已经发现了数百个与光合作用相关的候选基因，但其中有很多是假阳性【5】。该领域目前的挑战是鉴定真正与光合作用相关的候选基因，并确定已验证的光合作用基因的功能。

光合作用相关基因的鉴定

先前大规模莱茵衣藻的筛选中，由于多数突变株携带多个基因的突变，导致无法确定导致光合作用缺陷的具体基因，除非同一基因的多个独立突变体显示相同的缺陷。为了解决这个问题，研究人员开发了一种高通量的遗传连锁分析方法，可以高置信度地确定导致光合作用缺陷的特定基因。通过回交和插入DNA条形码测序的方法，研究人员成功鉴定了115个光合作用所需的基因。其中约有40%的基因在衣藻或陆生植物的光合作用中发挥作用。这些基因中有70个基因在光合作用中的分子功能从未被研究过。此外，研究人员还将研究结果与先前的光合作用筛查结果进行交叉验证，证实了这些基因确实参与光合作用。为了验证所鉴定基因在光合作用中的参与，研究人员通过基因回补实验来挽救突变体的光合作用缺陷（图1A）。在验证的36个基因中，成功回补了16个基因突变体的功能。其中有12个基因的光合作用功能未在任何生物中被报道过，有2个基因在衣藻中未被报道。这些基因涉及到转录后调控因子（RAA17、RAA15、PMR1、MTF1），光合机制的生物合成或修复因子（CPLD64、PIR1、CPL6、CGL54），以及新陈代谢（PSR1、CPL12和TPK1）等方面。同时，研究还发现部分基因表达的蛋白质定位在叶绿体中，这与它们在光合作用中的功能相吻合。

候选基因的功能表征与归类

通过质谱蛋白质组学分析，研究人员确定了115个光合作用必需基因的功能（图1B）。研究利用黑暗条件下使用醋酸盐作为衣藻碳源和能源的方式，避免了光照条件下光合作用缺陷对蛋白质组分析的干扰。通过分析突变体中蛋白质的丰度变化，研究揭示了一些蛋白质复合物的变化以及调控效应。研究还发现衣藻基因在蛋白质组水平上的行为与陆地植物的同源基因相似，这表明在衣藻中的研究结果对于理解绿色植物的光合作用具有重要意义。进一步的分析中，研究人员确定了23个特征不明确的基因在叶绿体蛋白质复合物形成或调控中的重要作用（图1C）。其中，7个基因的突变导致光系统II（Photosystem II，PSII）复合物的减少；4个基因的突变导致细胞色素b6f（cytochrome b6f）复合物的减少；18个基因的突变导致光系统I（Photosystem I，PSI）复合物的减少；5个基因的突变影响光合作用光捕获复合物；还有3个基因的突变主要导致叶绿体核糖体蛋白的减少。该研究结果为了解这些功能不明的基因在光合作用复合物形成和调控中的具体作用提供了线索，涉及到光合作用反应链中的关键步骤，如水的氧化、质子泵和电子转移，以及光合作用过程中的光能捕获和电子传输等。此外，研究还发现了11个基因对多个光合成复合物的形成或调控产生影响。这些基因的突变导致光合系统中多个复合物的减少（图1D）。一些已知基因突变的影响涉及到叶绿素生物合成或调控。例如基因PMR1和MTF1的破坏导致整个光合装置的减少。通过蛋白质组学实验和基因回补验证，研究人员还鉴定了多个调控基因，这些基因编码的蛋白质在光合作用复合物的稳定性和成熟方面起着关键作用，尤其是PSI的亚基PsaA。PSI复合物所需的6个核编码因子（M因子）MAC1、RAA1、RAA3、RAA4、RAA6和RAA8参与psaA mRNA的稳定或成熟。研究还发现HEL5、RAA15、RAA18、RAA12参与psaA的剪接。RAA17和RAT2分别与psaA外显子的稳定性和成熟相关。此外，研究还揭示了psaA mRNA成熟过程的复杂剪接机制，涉及多个剪接位点的相互依赖。

图1. 光合作用相关基因的鉴定和功能表征：（A）基因回补实验示意图；（B）质谱蛋白质组学分析过程；（C）调控叶绿体蛋白复合物的基因；（D）调控光合成复合物的基因。

光合作用的主要调控因子：MTF1和PMR1

接下来，研究人员重点关注了导致光合反应复合物水平降低的几个关键基因和蛋白质，并揭示了它们对光合作用调控的重要影响。首先，研究人员发现了两个叶绿体翻译起始的必需因子，它们是CIF2和MTF1。根据推测，CIF2可能是叶绿体翻译起始因子2（IF2），而MTF1（甲硫基- tRNA甲酰基转移酶1）是介导叶绿体翻译起始的MTF，几乎所有叶绿体编码的蛋白翻译都需要MTF1的参与。研究人员还发现了一个名为PMR1的蛋白质，它是光合作用的主要调控因子。PMR1通过调节核基因表达水平，协调多个光合作用复合物的表达。pmr1突变体显示出严重的光合作用生长缺陷和光反应复合物耗竭，而且PMR1可以直接调控数百种mRNA的水平。此外，PMR1通过调节核编码因子ROGEs的水平来调控光合作用复合物。pmr1突变体并不会影响光合作用复合物核编码亚基的mRNA水平，但是会表现出严重的ROGEs耗竭，从而影响光合作用复合物的表达。荧光标记定位分析结果显示，除了在细胞质和细胞核分布外，部分PMR1定位于叶绿体。这表明PMR1可能参与叶绿体向细胞核和细胞质的逆向调控过程。

综上所述，该研究使用遗传筛选方法鉴定了70个以前未知的基因，这些基因在模式藻类莱茵衣藻的光合作用中起关键作用。研究人员通过突变体蛋白质组学分析将这些基因归类到不同的生物途径，揭示了与光合作用生物合成和调控有关的因子，包括主要调控因子PMR1，它通过核编码因子调控叶绿体基因。这项研究为我们认识光合作用调控机制打开了新的大门。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.007

制版人：十一

参考文献

[1] Blankenship, R.E. (2008). Molecular mechanisms of photosynthesis.In Molecular Mechanisms of Photosynthesis(Wiley), pp. 1-321.

[2] Michelet, L., Zaffagnini, M., Morisse, S., Sparla, F., Pérez-Pérez, M.E.,Francia, F., Danon, A., Marchand, C.H., Fermani, S., Trost, P., et al. (2013). Redox regulation of the Calvin-Benson cycle: something old, something new.Front. Plant Sci.4, 470.

[3] Karpowicz, S.J., Prochnik, S.E., Grossman, A.R., and Merchant, S.S. (2011). The GreenCut2 resource, a phylogenomically derived inventory of proteins specific to the plant lineage.J. Biol. Chem.286, 21427-21439.

[4] Rochaix, J.D. (2002). Chlamydomonas, a model system for studying the assembly and dynamics of photosynthetic complexes.FEBS Lett.529, 34-38.

[5] Li, X., Patena, W., Fauser, F., Jinkerson, R.E., Saroussi, S., Meyer, M.T., Ivanova, N., Robertson, J.M., Yue, R., Zhang, R., et al. (2019). A genome-wide algal mutant library and functional screen identifies genes required for eukaryotic photosynthesis.Nat. Genet.51, 627-635.