最新综述：3个阶段合成，超10种方法优化底盘细胞，7种提取工艺

天然虾青素即天然虾红素，是已知最强的天然抗氧化剂之一。这是类胡萝卜素合成的最高级别产物，颜色呈现深粉红色，广泛存在于藻类、红酵母、鲑鱼、鱒鱼、磷虾、虾和小龙虾等水生动物中。

作为一种强效的抗氧化剂，虾青素的抗氧化能力比维生素 E 强 500 倍，比维生素 C 强 6000 倍，还具备高效的清除自由基能力。凭借这些特性，虾青素已被广泛应用于食品添加剂、化妆品、保健品、水生养殖和医药等领域。

目前，虾青素的生产方式主要有 3 种方法，化学合成法、提取法和微生物发酵法。随着合成生物学技术的持续发展，微生物发酵法合成虾青素日渐成为实现虾青素工业化生产最有效的途径之一。

近期，南京工业大学姜岷和信丰学等在《合成生物学》期刊上发表了一篇基于微生物发酵法合成虾青素的综述文章。

（来源：《合成生物学》）

这篇论文系统介绍了虾青素的结构性质和生产方法，重点讨论了虾青素天然合成以及外源构建的合成路径，并总结了雨生红球藻、酵母和大肠杆菌等不同微生物生产虾青素的最新进展，还分析了利用基因工程和发酵过程调控手段提高虾青素产量的方法。

论文的通讯作者是南京工业大学生物与制药工程学院的副教授蒋羽佳以及教授信丰学。信丰学的研究方向是从事低劣生物质转化利用、人工多细胞体系功能调控与强化研究，包括 GRAS 级安全酵母的开发和细胞工厂构建，尤其针对功能脂肪酸、胡萝卜素、 虾青素等医药营养品。

论文中提到，未来将通过代谢工程等手段提高虾青素产量，进一步增强虾青素在食品、医疗、化妆品和饲料等产业的应用。

分为 3 个阶段，微生物发酵合成虾青素

虾青素的生物合成途径大体可以分为 3 个阶段，第一阶段是中心碳代谢，第二阶段是甲羟戊酸途径（MVA）和甲基赤四醇 4-磷酸途径（MEP），第三阶段是虾青素合成阶段。

在中心碳代谢阶段，生物体通过葡萄糖等碳源经糖酵解途径（EMP）生成丙酮酸以及乙酰辅酶A 等萜类化合物的前体，这些前体物质会流向 MVA 和 MEP。

▲图 | 微生物合成虾青素的代谢途径（来源：《合成生物学》）

MVA 和 MEP 则是虾青素生物合成途径中的第二阶段。甲羟戊酸途径提供萜类合成所需的前体物和细胞生长必需物质的前体物，该途径从乙酰辅酶 A 开始经 6 步酶促反应生成异戊烯焦磷酸酯（IPP），再通过异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）将 IPP 异构化成二甲基烯丙基焦磷酸酯（DMAPP），最后以 IPP 和 DMAPP 为前体合成萜类化合物的前体物；

MEP 途径是另一条合成天然萜类化合物的前体供应途径，这一途径广泛存在于细菌、真菌、植物和藻类中。该途径从丙酮酸出发，经 7 步酶促反应生成 DMAPP，然后通过 IDI 将 DMAPP 异构化成 IPP，最后同样以 IPP 和 DMAPP 为前体合成萜类化合物的前体物。

第三阶段是虾青素合成，IPP 和 DMAPP 在法尼基二磷酸合酶作用下生成香叶基焦磷酸（GPP），GPP 继续在不同酶的作用下生成不同产物，最终生成 β-胡萝卜素，然后在 β 胡萝卜素分子环上的两端补充羟基与羰基，将 β-胡萝卜素转化为虾青素。

优化底盘细胞，提高虾青素产量

微生物发酵是一种极具前景的虾青素生产方法。目前用于发酵合成虾青素的微生物包括藻类、酵母、细菌等，领域内主要通过调控发酵过程和代谢工程改造菌种等策略提高虾青素产量。

比方说，通过优化发酵条件提高微生物虾青素产量，通过强化代谢路径中的 MVA 和 MEP 来提高前体物质的供应量；筛选表达不同来源的关键基因；模块化工程连接表达基因，增加拷贝数量；定位不同亚细胞器等。

自然界中的多种藻类可以用来生产虾青素，包括雨生红球藻、衣藻、伞藻和裸藻等，雨生红球藻是生产虾青素的一种主要藻类。但是，藻类面临生长周期长、培养条件要求高、需要光照、提取率低等问题。

因此，基于藻类生产虾青素需要采取多种优化方法。第一，改善光照环境反应器中光暗循环周期 更稳定、液体混合更均匀，增加次级代谢物产生；第二，添加可提升虾青素产量的外源物质，比方说 rac-GR24；第三，优化提取方法，有团队提出了一种利用可切换亲水性溶剂的提取新方法。

与藻类等微生物相比，酵母是目前虾青素工业化生产中最有潜力的底盘细胞之一。天然生产虾青素的酵母包括红法夫酵母，基于基因工程的工程化酵母包括酿酒酵母、解脂耶氏酵母以及马克斯克鲁维酵母等等。下文以红法夫酵母为例详细介绍提高虾青素产量的优化策略。

▲图 | 红法夫酵母生产虾青素的进展（来源：《合成生物学》）

红法夫酵母是合成虾青素理想的底盘细胞之一，综述中详细介绍了通过改造提高虾青素产量的方法。一是发酵条件，尤其是 pH 值，通过调控 pH 值可将虾青素产量比恒定 pH 发酵提高 24.1%；二是在发酵过程中添加某些物质（包括原钒酸钠和乙醇），调控代谢途径；三是通过诱变、关键基因编辑或删除以及代谢工程改造。

与藻类和真菌相比，细菌合成的虾青素产量较低，但是基于细菌生发酵更容易提取虾青素，可极大简化后续的提取工艺。大肠杆菌是研究最多且目前细菌中生产虾青素的更为理想的底盘细胞。

以大肠杆菌为例，领域内通过多种策略合成并提高虾青素产量。一是利用 MEP 途径和转化虾青素合成的相关基因，在大肠杆菌中进行共表达增加产量；筛选不同来源的虾青素合成基因 CrtW 和 CrtZ 是提升虾青素产量的常规方案之一；三是选用合适的虾青素合成基因元件；四是增加关键基因的拷贝数，这是提升虾青素产量简单、直接和有效的方式；五是其他非常规技术手段。

▲图 | 大肠杆菌生产虾青素的进展（来源：《合成生物学》）

3 类提取工艺

虾青素是胞内产物，因此需要从底盘细胞中提取出来，这一过程可分为破坏细胞和收集虾青素。提取虾青素的重点则在于细胞的破壁处理，传统的破壁处理方法包括物理法、化学法和酶法等。

物理处理方法涵盖了机械破碎、超声波破碎和超临界流体萃取等，超临界流体萃取是近年来各类藻产品提取虾青素最有效的萃取方法。

化学法主要包括有机溶剂萃取法、酸碱处理法、二甲基亚砜法等。前两种存在溶剂具有毒性，破坏产物以及造成环境污染等问题，相比之下，二甲基亚砜法更具有优势。这是一种既溶于水又溶于有机溶剂的极性溶剂，是实验室常用的破壁溶剂，能够快速高效破碎菌体细胞壁，不会对产物造成太大影响，且能够通过与丙酮按比例混合较为完全提取虾青素。

酶法提取具有条件温和，能耗小、耗时短等优点，用这种方法提取的虾青素比用其他方法提取更稳定。

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