FSHW | 油酸可有效提高植物乳杆菌的冷冻干燥存活率

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Introduction

冷冻干燥是一种通过将微生物的新陈代谢降低到非活性状态而对其生理特性产生作用的技术。它诱导休眠状态，抑制生长和繁殖，从而保持特定菌株的原始特征。冷冻干燥主要分为两个步骤。样品在低温下冷冻，样品中的水分在真空中升华和解吸。通过冷冻干燥制备的乳酸菌产品具有发酵活性高、遗传稳定性好、保质期长等优点。冻干过程中长期暴露在极端环境中，不可避免地会损害细胞，存活率往往不理想。

细胞膜是冻干过程中对细胞造成生理损害的最常见部位。主要原因是冷冻过程中细胞内形成的冰晶和干燥过程中对磷脂双分子层的破坏。有研究者提出细胞膜的完整性与细胞的生存能力直接相关，并影响到存活率。另外有研究者发现植物乳杆菌的冻干存活率与冻干过程中细胞膜的流动性密切相关。由此可见，膜的完整性和流动性的退化影响冻干存活率。然而，许多研究人员通过实验发现，改变细胞膜的脂肪酸分布可以提高冻干的存活率。

培养基的配方是影响冻干后存活率的另一个因素。吐温80、60和20是常用的非离子表面活性剂，加入培养基后对细胞生长和细胞膜的影响不同。有研究者发现，加入吐温20和吐温80可以促进细胞生长，而吐温60则没有明显影响。此外，加入吐温20和吐温80可以增加植物蛋白酶对压力条件的抵抗力，而吐温60没有这种作用。此外，在培养基中加入一定体积的吐温80会改变细胞膜的脂肪酸组成。吐温80是一种由油酸（C 18:1 cis-9）衍生的不饱和表面活性剂。

在本文中探讨不同类型和浓度的吐温 对植物乳杆菌冻干存活率的影响，并利用CRISPR-Cas9基因编辑系统和荧光双染色法进一步验证了不同结果的原因。 该研究为冻干过程中的新型通用保护策略提供了理论依据。

Results and Discussion

吐温类型和浓度对植物乳杆菌冻干过程中存活率的影响

从化学结构的角度看，吐温20、60和80是由环氧乙烷和各种酸酯缩合而成（图1a）。随着PBS的加入，在MRS培养基中加入Tween 20后，植物乳杆菌 WCFS1的存活率达到了最高的21.47%（图1b）。相比不添加吐温的存活率高8.26%，比添加吐温60的存活率高12%。在蔗糖的保护下，加入2倍浓度的吐温20后，植物杆菌WCFS1的冻干存活率最高可达93.1%。与添加2倍浓度的吐温80相比，添加吐温60之后的存活率从90.61%下降到64.29%。总体来说，添加吐温80或吐温20能显著提高植物乳杆菌WCFS1的冻干存活率，而添加2倍浓度的吐温80则表现出更好的效果。

此外我们为了探讨不同类型和浓度的吐温在冻干过程中对植物杆菌的存活率产生差异的可能原因，测定了冻干前细胞膜的脂肪酸组成和相对含量（图2）。这些结果表明，添加吐温80或吐温20可能通过增加细胞膜中油酸的含量来提高存活率。因此，油酸可以在冻干过程中保护菌株，尽管这种保护作用需要进一步验证。

图1 植物乳杆菌WCFS1在不同类型和浓度的吐温培养基中的冻干存活率

图2 吐温的种类和浓度对冻干前植物乳杆菌细胞膜的脂肪酸组成的影响

敲除菌株的构建和验证

油酸的生产需要三种酶的催化活性：CLA-HY，CLA-DH和CLA-ER酶（图3a）。其中发现cla-dh，cla-dc和cla-er位于植物乳杆菌WCFS1基因组中的相同基因簇中。如图3b所示敲除cla-er可阻断油酸的合成代谢途径。根据文献方法，构建了正确的基因敲除质粒，并命名为pLDQ12-cla-er（图3c）。电泳显示，AR113基因组的扩增产生了2754bp的条带，而cla-er缺失质粒产生的预期条带大小为2100bp。为了进一步验证，内部引物被设计在基因敲除基因内部。通过内部引物显示最小条带扩增的转化体为突变株，并进行了测序验证。正确的敲除菌株被命名为AR113Δcla-er和WCFS1Δcla-er（图3d）。敲除cla-er基因后，C18:1 cis-9（油酸）在两个单独的菌株中变得检测不到（图4），说明基因敲除对油酸含量有很大影响。

图3 在植物乳杆菌中敲除cla-er（a）多不饱和脂肪酸代谢途径，（b）编码植物乳杆菌中脂肪酸代谢酶的基因簇，（c）cla-er敲除菌株的电泳图，（d）cla-er单敲除菌株AR113Δcla-er和WCFS1Δcla-er的构建

图4 cla-er基因敲除对植物乳杆菌（a）AR113和（b）WCFS1冻干前脂肪酸组成的影响

敲除菌株冻干存活率的测定

AR113Δcla-er和WCFS1Δcla-er菌株表现出与野生型菌株相似的生长趋势（图5a-b）。在蔗糖的条件下，植物乳杆菌AR113Δcla-er的存活率明显下降。当使用含有0.001%油酸的蔗糖时，AR113Δcla-er的冻干存活率恢复到了与野生型菌株相同的水平（图5c）。当用山梨醇保护时，植物乳杆菌WCFS1Δcla-er的冻干存活率下降到比野生型菌株低2.11倍。然而，使用含有0.001%油酸的山梨醇，WCFS1Δcla-er的冻干存活率恢复到野生型菌株的水平（图5d）。这些结果表明，cla-er基因敲除不影响生长，但对植物杆菌菌株的冻干存活率有影响。外源油酸的添加弥补了这一缺陷，恢复了冻干存活率，进一步验证了油酸在植物乳杆菌冻干过程中起到了保护作用。

图5 （a-b）cla-er基因敲除对植物乳杆菌生长的影响；（c-d）cla-er基因敲除对植物乳杆菌菌株冻干存活率的影响

油酸对植物乳杆菌冷冻干燥下生存影响的机制

冷冻干燥植物乳杆菌AR113Δcla-er和WCFS1Δcla-er后，可观察到受损细胞数量增加（红色），突变株对膜完整性的损害比野生型菌株更严重。其中在山梨糖醇和蔗糖条件下更为明显（图6a-b）；然而当添加油酸后，敲除菌株中受损细胞的数量显着降低到与野生型菌株相似的水平。虽然 cla-er 敲除降低了冻干后植物乳杆菌的细胞膜完整性，但外源添加油酸增加了细胞膜的弹性，从而降低了干燥升华过程中的破裂程度，保护了植物乳杆菌的生存能力。这一现象进一步证实了冷冻干燥存活率分析的结果（图4），并表明油酸可以通过保护细胞膜完整性来提高存活率。

图6 cla-er基因敲除对冻干后植物杆菌细胞膜完整性的影响

Conclusion

冷冻干燥是保护益生菌最常用的方法之一，但在此过程中不可避免地出现生理损伤，降低了细胞存活率。尽管保护剂被用来减轻细胞损伤，但需要考虑具体的培养条件。在这项研究中，我们发现通过添加不同类型和浓度的吐温，植物乳杆菌的冻干存活率得到提高。利用基因敲除技术，我们进一步验证了油酸在冻干过程中起到了保护作用。在外源添加油酸后，基因敲除菌株的存活率可以恢复到野生型菌株的水平。总之，我们的研究结果为提高冻干益生菌的活性提供了新的信息，并为其背后的保护机制提供了理论依据。

第一作者

夏永军，博士，上海理工大学健康科学与工程学院副教授。2012年毕业于江南大学，获发酵工程专业博士学位。主要从事食品微生物资源开发及应用工作，包括益生菌资源挖掘、功能机制解析及其在乳制品、果蔬制品中的应用研究；牛樟芝等食药用真菌活性代谢产物代谢调控、活性评价以及构效关系研究。主持国家自然基金面上项目、十三五国家重点研究计划等国家和省部级科研项目5项，主持横向技术开发项目9项，相关研究成果获上海市科技进步一等奖、上海市技术发明奖一等奖、日内瓦国际发明奖金奖；申请发明专利40余项，其中授权18项，发表科研论文30余篇，其中SCI收录16篇。

通信作者

王光强，博士，上海理工大学健康科学与工程学院教授、博导。2014年1月毕业于江南大学食品学院，获食品科学专业博士学位。主要从事从事益生菌特性的分子机制研究、益生菌高活性保持机制及技术研究和基于益生菌的生物活性物质制造和递送。先后主持国家自然科学基金面上2项和青年项目各1项，国家重点研发任务1项，以第一作者或者通讯已发表SCI论文近30篇，EI论文5篇，获授权发明专利13项，申请专利16项。

The protective effect of oleic acid on Lactiplantibacillus plantarum during freeze-drying

Yongjun Xiaa, Yizhen Wanga, Jing Pua, Yan Wub, Zhiqiang Xionga, Xin Songa, Hui Zhanga, Lianzhong Aia, Guangqiang Wanga,*

a Shanghai Engineering Research Center of Food Microbiology, School of Health Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

b Department of Food Science & Technology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

*Corresponding author.

Abstract

Membrane characteristics are determined by the fatty acids composition, which affects survival rates after freeze-drying. However, it is unknown which composition provides the greatest effect. In this study, we found that the addition of Tween 80 and Tween 20 significantly increased survival rates of Lactiplantibacillus plantarum, which reached a maximum of 93.1%. Conversely, Tween 60 caused a significant decrease. We further found that the difference between the effects of adding Tween 80 and Tween 60 was the change in oleic acid contents. To verify the role of oleic acid, we used CRISPR-Cas9 to knock-out the key synthesis gene cla-er. The survival rates of L. plantarum AR113Δcla-er declined to 5.48%. The addition of oleic acid restored the rates to those of wild type strains. Moreover, the membrane integrity and fluidity of knockout strains markedly decreased. This is the first confirmation that Tween 80 or Tween 20 increases the survival rate by increasing the content of oleic acid in the cell membrane. These findings also indicated that oleic acid in cell membranes has a substantial protective effect on L. plantarum during freeze-drying.

Reference:

XIA Y J, WANG Y Z, PU J, et al. The protective effect of oleic acid on Lactiplantibacillus plantarum during freeze-drying[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2355-2361. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.039.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意