做肿瘤糖酵解研究，这个检测少不了

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Seahorse能量代谢分析仪主要功能

1、采用超敏感的生物传感器和非接触式设计，真正实现检测细胞零损伤；

2、实时检测细胞线粒体、糖酵解的能量代谢情况，即时反应细胞生理状态；

3、同步检测细胞的耗氧量和产酸率（pH值变化），数据结果更加全面；

4、实现同时检测96个细胞样品，通量高，速度快；

5、自动化控制检测流程、自动化控制添加多达四种药物，操作方便高效。

原理

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Seahorse XF 技术可测量微孔板细胞周围培养基中的氧通量（即耗氧率，oxygen consumption rate，OCR）和质子通量（即细胞外酸化率extracellular acidification rate，ECAR）。OCR 与线粒体呼吸成正比，而 ECAR 与糖酵解成正比。

▲XF技术原理（2分11秒）

1. 有氧呼吸（线粒体呼吸）

因为有氧呼吸是在第三阶段（氧化磷酸化阶段）才消耗氧分子，所以测定氧消耗速率反映的是有氧呼吸的水平以及潜力的变化。既然XF技术是实时检测氧气含量变化，那么我们肯定是需要细胞耗氧能力发生变化的，所以我们可以将呼吸链上的不同蛋白逐个抑制掉。

1.1 ATP合成酶抑制剂——Oligomycin（寡霉素）

ATP合成酶，即线粒体复合物V，是有氧呼吸最后一步释放大量能量的关键分子，其活性若被抑制则有氧呼吸在最后一步（合成ATP）被终止，而前一阶段（氧与质子以及电子生成水）因下游“拥堵”导致耗氧停止(个人理解，若有误，请大咖们批评更正)。下降的这部分为ATP production（这个概念很容易理解）或ATP-linked respiration（这个概念不是很好理解，我的疑问是这个概念似乎更应该直接抑制complex IV，这样可以直接终止其介导的耗氧反应）。

▲线粒体膜上电子传递链以及测试过程中使用的四种药物

2.2 线粒体解偶联剂——FCCP

这里的解偶联解的是氧化反应和磷酸化反应之间的偶联，氧化反应可以理解为电子的传递过程，这个过程中会总伴随着自由能的释放（即形成质子梯度差），在ATP合成酶介导的最后一步反应时，这些自由能转化到了ATP中。FCCP可以通过减小质子在线粒体内膜两侧的梯度差，导致氧化反应和磷酸化反应不再偶联，但复合物IV介导的耗氧反应仍可继续，氧消耗率继续上升，线粒体膜间区域的质子浓度继续上升，直至达到上限。高出基础耗氧的部分即为储备有氧呼吸能力（reserve capacity）。

▲线粒体压力测试图谱

2.3 复合物 I 和 III （有氧呼吸）抑制剂——鱼藤酮和抗霉素（rotenone & antimycin）

电子传递链的起点复合物 I 以及复合物 III 被抑制则整个氧化磷酸化（线粒体呼吸）过程被抑制，因此剩下的则是非线粒体驱动的耗氧。

看到这里，你是不是觉得，做了上述指标的检测跟我们标题所说的糖酵解基本没啥关系？

对的，可以说基本没啥关系，但也可以顺便测一下。我们重点要做的糖酵解还得看下面的内容！

2. 胞外酸化率（反映糖酵解总体功能）

葡萄糖经酶促反应生成丙酮酸这一过程为糖酵解，在此过程中，不需要消耗氧，所以跟前面的耗氧率没有啥关系。在没有线粒体的参与下，丙酮酸最终转化为乳酸，排到细胞外。所以，我们通过另一个指标来反映糖酵解——酸化率。

2.1 呼吸的起点——葡萄糖

加葡萄糖后开始第一步反应，糖酵解，这很好理解。

2.2 ATP合成酶抑制剂——寡霉素（Oligomycin）

这里跟前面是一样的作用，主要用来阻断有氧呼吸最后一步。为什么不用鱼藤酮、抗霉素抑制复合物I和III抑制有氧呼吸的开始，目前还不是很能理解。等我搞明白了，再来补充。

2.3 糖酵解抑制剂——2-DG

2-DG(2-脱氧葡萄糖)可与葡萄糖竞争性结合糖酵解途径的己糖激酶（糖酵解第一个限速酶），因而抑制糖酵解。

▲糖酵解压力测试图谱（糖酵解功能关键参数）

3. 糖酵解质子流出率（更进一步表征糖酵解的实时变化）

除了检测耗氧率和胞外酸化率，Seahorse XF技术还可以检测质子流出率（proton efflux rate，PER）。主要利用鱼藤酮/抗霉素和2-DG来相应地改变有氧呼吸和糖酵解的质子流（如下图）。

▲糖酵解速率检测原理

▲安捷伦 Seahorse XFp 糖酵解速率测定图谱。

活细胞的质子外流包括糖酵解和线粒体源性酸化。线粒体酸化。通过线粒体功能的抑制作用。(Rot/AA) 对线粒体功能的抑制作用，可计算线粒体相关的酸化。将线粒体酸化减去总质子流出率，得出糖酵解质子流出率。

Agilent Seahorse XFp 糖酵解速率分析仪的原理。能量由细胞内的两种途径产生--糖酵解和线粒体呼吸。在糖酵解过程中，葡萄糖分解为乳酸时，质子被挤出到细胞外介质中，XFp 分析仪检测到的是 ECAR。此外，线粒体 TCA 活动会产生二氧化碳，使培养基水化和酸化。在检测过程中使用复合体 I 和复合体 III 线粒体抑制剂（Rot/AA）抑制呼吸作用（OCR），可计算出呼吸作用的质子外流率，并从总质子外流率中去除，得出糖酵解质子外流率（glycoPER）。为确认途径的特异性，注入糖酵解抑制剂 2-DG，以阻止糖酵解酸化。

更多背景知识

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一、有氧呼吸的三个阶段

1. 糖酵解

葡萄糖在细胞质基质中分解为两分子的丙酮酸，释放少量能量：C6H12O6+酶→2丙酮酸（C3H4O3)+4[H]+能量（2ATP）。

2. TCA循环/柠檬酸循环

线粒体基质中，两分子的丙酮酸分解为CO2和少量能量：2丙酮酸（C3H4O3)+6H2O+酶→6CO2+20[H]+能量（2ATP）。包含乙酰CoA的形成这一准备阶段，乙酰CoA进入线粒体内参与的这个循环才是严格意义上的TCA循环阶段。

3. 氧化磷酸化

这需要线粒体内膜上的呼吸链的参与，又被称为电子传递链（electron transport chain）磷酸化。线粒体内膜上，ETC与氧结合，释放大量能量：24[H]+6O2+酶→12H2O+能量（34ATP）。

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氧化磷酸化的工作原理是利用释放能量的化学反应来驱动需要能量的反应：这样的反应称为是偶联反应。电子在电子传递链上从电子供体（如NADH）到电子受体（如氧）的流动，是一个放能的过程，而ATP的合成是一个耗能的过程，需要输入能量。电子传递链和ATP合酶都在膜中，在称为“化学渗透”的过程中，通过质子穿过这层膜的运动，将能量从电子传递链转移到ATP合酶中。

前两个阶段获得的ATP属于底物水平的磷酸化（高能化合物通过酶促反应使能量传递给ADP生成ATP），而氧化磷酸化是指电子在从被氧化(需氧)的底物传递到氧的过程中，释放出来的自由能推动ADP生成ATP的过程。

呼吸链（即ETC）由四部分组成: 复合体I(NADH) 、复合体II(FADH2）、复合体III和复合体IV。除此之外，还需要泛醌（CoQ）和细胞色素C（CytC）参与电子的传递。传递顺序如下 (从左到右) ：

图1. 呼吸链【1】

由于线粒体内膜的两侧的氢离子浓度存在高低梯度(内侧（膜间区域）浓度比外侧（线粒体基质区域）浓度大)，而位于内膜上的ATP合成酶（复合物V），可以将氢离子通过F0的氢离子通道，使氢离子从高浓度的内侧回流到低浓度的外侧，即回流到线粒体基质中，而 F1通过氢离子回流的能量，驱动ADP生成ATP。

图2. 呼吸链上全部复合物及其相应功能【3】

二、名词解释

氧化磷酸化是一个生物化学过程，发生在真核细胞的线粒体内膜或原核生物的细胞质中，是物质在体内氧化时释放的能量通过呼吸链供给ADP与无机磷酸合成ATP的偶联反应。

ATP合成酶，又称FoF₁-ATP酶在细胞内催化能源物质ATP的合成。在呼吸或光合作用过程中通过电子传递链释放的能量先转换为跨膜质子(H+)梯度差（可想象为高水位的势能），之后质子流顺质子梯差通过ATP合酶驱动使ADP和磷酸盐（Pi）合成ATP（类似水流带动发电机发电）。合成一个ATP分子所需的质子数估计为为3至4个。

解偶联剂（uncoupler），指一类能抑制偶联磷酸化的化合物。能使氧化与磷酸化脱离(即解偶联)，虽然氧化照常进行，但因不能进行磷酸化而不能生成ATP，使P/O比值降低，甚至为零。FCCP（全称是Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，同CCCP；酸性芳香族化合物）是一种有效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂 (IC50 = 20 nM)，是一种代谢毒素，通过跨线粒体内膜运输质子（H+能够直接通过线粒体内膜扩散，而无需通过ATP合成酶，见图3右上角部分）来破坏 ATP 合成，使线粒体膜电位去极化。

图3. 细胞呼吸过程【4】

糖酵解质子流出率（glycolytic proton efflux rate，glycoPER)，糖酵解过程中源自糖酵解的质子向细胞外介质中排出的速率，不考虑CO2依赖性酸化的作用。这一测量结果与细胞外乳酸生成率高度相关。

质子渗漏（proton leak）：质子迁移到基质中，但没有产生 ATP，这使得底物氧和 ATP 的产生不能完全耦合。

有氧糖酵解，在正常生理情况下，细胞只在限氧条件下进行糖酵解，而癌细胞即使在有氧条件下也倾向于进行糖酵解；这被称为沃伯格（Warburg）效应或有氧糖酵解，是癌细胞与正常细胞的区别所在。

▲肿瘤细胞Warburg效应与正常细胞的有氧呼吸代谢途径的比较【6】

参考文献

1. https://www.zhihu.com/question/416165432

2. https://zhuanlan.zhihu.com/p/629486604

3. https://istudy.pk/electron-transport-chain/

4. https://www.chegg.com/homework-help/questions-and-answers/refer-summary-diagram-cellular-respiration--fccp-metabolic-poison-allows-mathrm-h-diffuse--q122295525

5. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103346-400.pdf

6. Arora A, Singh S, Bhatt A N, et al. Interplay between metabolism and oncogenic process: role of microRNAs[J]. Translational oncogenomics, 2015, 7: 11.

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