产量超过17g/L，青岛能源所实现高水平神经酸合成，相关专利已授权浙江震元

神经酸是一种超长链单不饱和脂肪酸（C24:1），在大脑白质及髓鞘中含量丰富。越来越多的研究证明，神经酸有益于神经系统健康，并且具有治疗肾上腺脑白质营养不良和多发性硬化症的潜力。

长久以来，神经酸主要提取自植物种子，来源受限。在稀有植物 Malania oleifera 和草本植物 Tropaeolum spiosum 和 Cardamine graeca 的种子中，神经酸占总脂肪酸 (TFA) 的 40% 以上；元宝枫籽油的神经酸含量在 6% 左右，在中国作为营养保健品出售；一些微藻和丝状真菌中也发现了神经酸：产油微藻 Mychonastes afer HSO-3-1和丝状真菌 Mortierella headata 可合成神经酸，分别占 TFA 的 3.8% 和 6.9%。

随着合成生物学的兴起，微生物发酵法合成神经酸成为新的技术趋势。

近日，来自中国科学院青岛能源所的研究团队利用产油酵母解脂耶氏酵母，通过系统代谢工程过量生产神经酸。相关文章以题为“”发表于 Communications Biology 期刊。论文通讯作者是能源所和。

围绕生物质降解和以富碳气体为原料的合成生物学应用开展研究。研究方向有嗜热微生物的多糖降解酶催化机制以及生产生物燃料的高效细胞工厂构建，为生物能源的开发提供上游工艺和技术支持；目前主要聚焦 GRAS 级（通常认为安全）酵母底盘，开展油脂和蛋白合成研究。

产油酵母解脂耶氏酵母常被用作通过代谢工程生产脂质和非脂质化学产品的宿主。这种酵母的代谢特性使其适合生产脂肪酸，如多不饱和二十碳五烯酸（EPA）、γ-亚麻酸（GLA）等。杜邦公司就通过在解脂耶氏酵母中延伸和去饱和，成功地从 C18:1-CoA 合成了 EPA，并将富含 EPA 的油用于食品。

神经酸合成途径的关键步骤是由 β-酮酰辅酶 A 合成酶（KCS）催化的从 18 碳到 24 碳的延伸。 KCS 是长链单不饱和脂肪酸（VLCMFA）合成的限速酶。

▲图 | 工程化解脂耶氏酵母中神经酸生产的生物合成途径（来源：上述论文）

作者通过在解脂耶氏酵母菌株 po1g 中表达来自 C. graeca 的 CgKCS 基因，产生了少量的神经酸，占脂肪酸的 1.4%。

理论上，C18:1-CoA（油酸），C20:1-CoA，C22:1-CoA都可作为 CgKCS 生产神经酸的底物，因此，作者在 CgKCS 的背景下共表达了专一生产 C20:1-CoA 的 AtFAE1（源自拟南芥）以及专一生产 C22:1-CoA 的 BtFAE1（源自大白菜），但构建出的 YL-3FAEs 对比单一表达 CgKCS 的 YL-CgKCS 并没有显著提高神经酸的含量。由此得出，在解脂耶氏酵母中，CgKCS 不能有效利用 C20:1 和 C22:1， 油酸是 CgKCS 用于催化生产神经酸的底物。

CgKCS 的过表达也导致了棕榈油酸（C16:1）产量的上升，从占脂肪酸的 13.5%增加到 27.3%。但是棕榈油酸不能作为合成神经酸的底物。

为了提高 C18:1/C16:1 的比例，作者在酵母中表达了来自不同物种的专一催化 C16:0-CoA 到 C18:0-CoA 的脂肪酸延伸酶：gELOVL6，rELO2，CpLCE1；以及专一催化 C18:0-CoA 到 C18:1-CoA 的 9 位去饱和酶：MaOLE2，CeFAT6，D9DMB。其中，gELOVL6 和 MaOLE2 对 C16:1 到 C18:1 的转化有显著效果。共表达 CgKCS，gELOVL6 和 MaOLE2 的 YL-3CgKE 菌株中的棕榈油酸含量降低了 40.5%，神经酸的含量提升到总脂肪酸的 15.9%。但摇瓶培养中的脂质滴度仅为 2.1g/L。

因此，作者将 YL-3CgKE 与油脂高产菌株 po1g-G3 通过同源重组的方法，在 rDNA，FAD2，TGL4，GSY1 和 SNF1 位点（SNF1 是调控酵母脂肪积累的重要基因之一）上整合了多达 6 个拷贝数的 CgKCS 基因，构建的 YLNA7 菌株在摇瓶中产出了浓度为 2.6g/L 的神经酸，占总脂肪酸的 16.5%。MaOLE2 的产物 C18：1-CoA 正好是 CgKCS 的底物，作者通过 10x 甘氨酸将这两个酶偶联起来，使 C18：1-CoA 更高效地被 CgKCS 利用，使神经酸产量提高到 17.3%。

▲图 | 通过同源重组构建神经酸高产菌株（来源：上述论文）

内质网是脂肪酸生物合成途径的重要场所，许多脂肪酸合成相关的酶都定位在内质网上。INO2/INO4 在酿酒酵母中是调控内质网结构的转录因子，作者通过序列比对找出了解脂耶氏酵母中对应的 YlINO2/YlINO4。在 YLNA8 的背景下，过表达 YlINO2 将脂质总产量和神经酸产量分别提高到 21.1g/L 和 3.5g/L。通过透射电子显微镜观察到，过表达 YlINO2 扩大了内质网的面积。

此外，作者还在摇瓶和 3L 反应器中优化发酵培养基和条件。在两轮优化实验中，含有 150g/L 葡萄糖、6g/L 酵母提取物和 12g/L 硫酸铵的培养基表现出最佳的脂质生产。

在优化发酵培养基和条件的基础上，分别采用菌株 YLVL10 和 YLNA9 在 50L 反应器中进行中试发酵。其中，YLVL10 在发酵过程中 192 小时不断合成脂质和神经酸，神经酸和 VLCFA 的滴度分别达到 10.2g/L 和 24.0 g/L；YLNA9 在 216 小时内不断合成脂质和神经酸，神经酸和 VLCFA 的滴度分别达到 17.3g/L 和 28.2g/L，且最大脂质滴度为 96.7g/L。

总之，本研究对产油酵母解脂耶氏酵母进行了改造，使其能够以迄今为止多级代谢工程报道的最高效价 17.3g/L 生产神经酸。提高脂肪酸延伸的碳通量可有效提高神经酸和总 VLCFA 的产量。新鉴定的内质网结构调节因子 YlINO2 的过表达能使脂质产量增加 39.3%。另外，神经酸的概念验证纯化和分离产生了 98.7% 的纯度。

据悉， 相关技术已转让浙江震元生物科技有限公司 ，正为申报新食品原料做准备工作。

参考资料：

1.https://news.sciencenet.cn/htmlnews/2023/7/504224.shtm

2.https://www.163.com/dy/article/HBJQ2E2P0552HT21.html

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