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科学家开发RNA端帽系统级定量分析技术,对RNA端帽组实现准确且灵敏的量化

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20 世纪 70 年代初,科学家在病毒和真核生物的 mRNA 中,发现了位于 5’ 末端的端帽(转录过程中在新生转录本中形成的一种独特的化学修饰)。当时,通过利用放射性同位素标记、RNA 酶解以及色谱法或电泳法分析,对其进行发现和鉴定。

自此掀起了研究热潮,人们陆续发现了 RNA 端帽的多种生物学功能(如调控 RNA 代谢和功能)和多种结构,也开发出多种其他端帽分析方法。并且,基于这些发现和分析方法开发了诸多 RNA 端帽的相关应用。

例如,2023 年诺贝尔生理学或医学奖颁予的 mRNA 疫苗技术,就是使用了体外合成的含端帽的 mRNA 作为 mRNA 疫苗的有效成分(抗原 mRNA),这在抗原 mRNA 在体内的稳定性和高效翻译发挥了关键作用。

但是,现有 RNA 端帽分析技术存在一些局限性,例如,仅限于个别端帽、定量性不佳、灵敏度不高等。


图丨王进(右一)与课题组成员(来源:)

鉴于此,内蒙古大学与麻省理工学院等团队合作,开发出了一种系统级的 RNA 5’ 端帽分析技术,名为“CapQuant”。

该技术运用 RNA 纯化与酶解、离线液相色谱法富集、同位素稀释以及液相色谱-串联质谱分析等技术手段,不仅克服了 RNA 端帽分析的诸多难点,还实现了对生物体内 RNA 端帽表观转录组准确、特异且灵敏的量化。

值得关注的是,该技术可在宽泛的动态范围内,对多种 RNA 端帽结构进行绝对定量,且检测限低至阿摩尔(即 10 -18 摩尔)水平。该技术能够同时分析 26 种端帽结构,并且很容易扩展到其他的端帽结构。例如,前体转运 RNA(pre-tRNA)中存在的甲基化端帽。

该课题组使用该技术在细胞和病毒 RNA 中,发现了四种新型的端帽结构,包括黄素腺嘌呤二核苷酸、二磷酸尿苷葡糖、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖胺及 m 7 Gpppm 6 A [1]。


图丨RNA 端帽的代表性化学结构(来源:Nature Protocols)

不久前,相关论文以《一种系统级、基于质谱的 RNA 端帽表观转录组准确、灵敏定量技术》()为题发表在 Nature Protocols[2]。

内蒙古大学研究员为该论文的第一作者兼通讯作者,新加坡南洋理工大学周炳良()博士为论文共同第一作者,彼得·C·德顿()教授为论文共同通讯作者。

图丨相关论文(来源:Nature Protocols)

CapQuant 技术具有普适性,可广泛应用于准确、灵敏地量化任何来源(例如生物体 RNA、体外来源 RNA 等)的带帽 RNA 的端帽景观。“当研究人员发现新的端帽结构时,很容易将其引入我们的新方法以便对其进行分析。”表示。

具体来说,例如,该技术可用于定义细胞和组织中的基线端帽景观,而且定量端帽基线能够为量化细胞周期、细胞应激、环境变化以及生理、病理的不同状态中的端帽景观的变化提供良好的基础。该技术还可以用于合成、修饰或去除端帽的酶的发现和功能注释,以及揭示端帽结合蛋白在控制基因表达中的作用。

此外,当与转录本特异性纯化技术或端帽特异性亲和纯化技术结合时,该技术可以量化特定类型 RNA 中的端帽,为研究转录本的特异性加帽、去帽过程,以及基因特异性调控提供了新的途径。

当该技术应用到体外来源的 RNA 时,它可以用来发现新的 RNA 加帽、去帽或修饰帽的酶,也可以建立(高通量)筛选方法用于发现可作为潜在治疗药物的端帽酶的抑制剂或激活剂。

“并且,它还能够以稳健、简单的方式,准确地揭示带帽 RNA 的转录起始位点。长期以来,学术界和工业界最常用的转录起始位点分析方法大约需要 70 步,而我们的方法大大简化了这个过程。”说。

研究团队认为,虽然其使用稳定同位素内标物,提供了高准确度的端帽绝对量化,但未来,研究人员也可以通过使用未标记的标准品建立外部校准曲线,或间接使用其他化学类似的端帽标准品,进行精确的端帽量化。


图丨量化细胞和组织 mRNA 中的 5’ 端帽表观转录组的工作流程(来源:Nature Protocols)

在核酸领域已经积累了 20 年的研究经验,并取得了系列创新性科研成果。他本科毕业于武汉大学,在香港浸会大学获得博士学位,之后在美国加州大学河滨分校及麻省理工学院 SMART 中心分别从事博士后研究和担任研究科学家。2018 年,他回国加入内蒙古大学生命科学学院、省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室。

在基础研究方面,课题组目前主要研究 RNA 端帽表观转录组的生理、病理调控机理,及其在动物胚胎发育、干细胞分化、马铃薯发育等重要生命过程中的动力学和作用。在转化研究方面,主要开展 RNA 新药和加帽酶靶向抑制剂的研发。例如,最近,他们正在开发针对一种重要人兽共患病的 mRNA 疫苗。

据悉,为了学以致用,于 2022 年在北京创办了一家专注于核酸药物技术创新与核酸药物研发的创新性生物科技初创公司。“我们致力于核酸药物原创性底层核心技术的开发,以及原创性生物技术与疗法的研发,希望能够在不远的将来,在相关方面取得突破。”他说。


参考资料:

1.Wang, J. et al. Quantifying the RNA cap epitranscriptome reveals novel caps in cellular and viral RNA. Nucleic Acids Research 47,20,18,e130(2019). https://doi.org/10.1093/nar/gkz751

2.Wang, J., Chew, B.L.A., Lai, Y. et al. A systems-level mass spectrometry-based technique for accurate and sensitive quantification of the RNA cap epitranscriptome. Nature Protocols 18, 2671–2698 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-023-00857-0



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