《Bioactive Materials》中山大学白莹/袁进：双交联再生水凝胶用于无缝合线角膜缺损的长期修复

近日，中山大学材料科学与工程学院白莹教授团队携手中山大学中山眼科中心袁进教授团队在《Bioactive Materials》（中科院1区，IF:18.9）发表题为“Dual-crosslinked regenerative hydrogel for sutureless long-term repair of corneal defecte”的原创研究论文。

该研究利用CMC/NHS和苯基-2,4,6三甲基苯甲酰亚磷酸酯(LAP)诱导光交联，通过非竞争性双交联工艺，设计了一种由猪去细胞角膜基质水凝胶(pDCSM-G)和甲基丙烯酸透明质酸(HAMA)组成的双网络水凝胶。pDCSM-G组分具有良好的生物学特性，而HAMA主要增强水凝胶的形状和结构稳定性。

该水凝胶具有以下优势：

（1）不仅可以直接填充到各种形状的角膜缺损中，而且可以通过与邻近组织形成互穿网络和稳定的酰胺键，表现出优异的粘附性能，实现无缝合修复。

（2）不仅保留了PDCSM的生物活性成分，而且具有与角膜匹配的透明性、低溶胀率、降解慢、力学性能提高等特点，能够承受超高眼压。

（3）大大改善了HAMA较差的细胞粘附性能，支持了角膜细胞的活力、增殖和角膜细胞表型的保存。

双交联杂化水凝胶具有生物活性高、成本低、实用性强等优点，可有效地用于角膜缺损后的长期无缝合治疗和组织再生。

图1.水凝胶的应用、合成和生物分子组成。(A)将杂化水凝胶应用于原位角膜缺损以进行长期再生修复的示意图。定量分析(B)DNA、(C)胶原蛋白和(D)GAG在鼻咽癌和pDCSM-G中的含量。

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研究背景

角膜损伤是角膜瘢痕和基质变薄的常见原因，可导致视力下降甚至失明。人工角膜移植是目前临床上治疗角膜盲最有效的方法，但需要健康的植入物、先进的手术技巧和专门的设备。并且，全球供体严重短缺和免疫排斥、感染的固有风险限制了角膜移植。因此以生物材料为基础的人工植入物/封闭剂已成为促进角膜内源性再生的极具吸引力的材料。与供体角膜移植和预成型水凝胶移植相比，仅替换受损组织成为一种更有吸引力的修复局灶性角膜缺损的策略。原位形成的具有组织粘附性和凝胶前流动性的透明水凝胶已成为治疗角膜损伤的新选择。

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研究方案

（1）材料表征

对混合水凝胶的生物分子组成、透明度、表面形貌、溶胀率和降解性能进行了表征。以组织相容性刚度和黏附性为指标，优化机械强度和黏附性能。

图2.水凝胶的光学、溶胀、降解和微观表征。(A)将制备好的水凝胶样品(厚度约1毫米)的照片放在贴有“SYSU”标签的纸上。这5个水凝胶样品是：(I)光交联1%HAMA，(Ii)在37◦C物理交联3%不含CMC/NHS的pDCSM-G，(Iii)CMC/NHS交联3%pDCSM-G，(IV)在37◦C不含CMC/NHS的光交联型C3H1杂化水凝胶，以及(V)双交联C3H1水凝胶。(B)上述五种水凝胶样品的可见光透过率。(C)光交联型1%HAMA、CMC/NHS交联型3%PDCSM-G和双交联型C3H1水凝胶在37◦C的PbS溶液中浸泡两天后的溶胀率。(D)光交联型1%HAMA、CMC/NHS交联型3%pDCSM-G和双交联型C3H1水凝胶在37◦C、5U/mL I型胶原酶溶液中60天内的长期降解行为。(E)冷冻干燥的光交联型1%HAMA、CMC/NHS交联型3%pDCSM-G和双交联型C3H1水凝胶的扫描电子显微镜照片。

图3.化学交联型水凝胶的力学特性。(A)光交联型1%HAMA、CMC/NHS交联型3%pDCSM-G和双交联型C3H1水凝胶在光照前后的流变性研究。(B)化学交联后的1%HAMA、3%pDCSM-G和C3H1水凝胶的储存模数，用流变仪进行表征。(C)不同组成的HAMA和pDCSM-G水凝胶的压缩模数。(D)不同组成的HAMA和pDCSM-G水凝胶的剪切强度。(E)用于爆裂压力测试的人工前房装置的照片。(F)不同组成的HAMA和pDCSM-G水凝胶的平均破裂压力。(**P<0.001，*P<0.0001)

（2）体外实验

为了验证双交联型C3H1水凝胶的细胞相容性，分别用人角膜上皮细胞和原代兔角膜基质细胞在水凝胶上进行细胞培养，并以1%HAMA、3%pDCSM-G和组织培养板作为对照。体外细胞培养结果表明，双交联型C3H1水凝胶中的pDCSM组分具有较高的生物活性，这使得杂化水凝胶具有良好的生物相容性，有利于细胞的黏附、存活和增殖，并有助于维持角膜基质细胞的表型。

图4.角膜上皮细胞和角膜基质细胞在HAMA、pDCSM-G、C3H1水凝胶和TCP上培养。(A)角膜上皮细胞在1%HAMA、3%pDCSM-G、C3H1水凝胶和磷酸三钙上分别培养1、4、7天后进行活/死染色。比例尺=2 0 0μm。(2)用活/死实验测定水凝胶和磷酸三钙上角膜上皮细胞的活力。(C)培养1、4、7d的角膜上皮细胞进行CCK-8检测。(D)角膜基质细胞在1%HAMA、3%pDCSM-G、C3H1水凝胶和磷酸三钙上培养1、4和7天，进行活/死染色。标尺=2 0 0μm.(E)用活/死实验测定水凝胶和磷酸三钙对角膜基质细胞活性的影响。(F)培养1、4、7d的角膜基质细胞进行CCK-8检测。(G)定量逆转录聚合酶链式反应分析兔角膜基质细胞在C3H1水凝胶和磷酸三钙上培养4天后，胶原1A1、3A1、ACTA2、转化生长因子-β1、LUMICAN和角化蛋白的相对表达水平。

（3）体内实验

为了评价化学交联型水凝胶在临床应用的可行性，采用环钻法在兔角膜基质中引入直径约3.5 mm的圆柱形缺损区，建立兔角膜缺损模型。在8周的体内评估中，双交联水凝胶填充的实验眼保持透明，与基质床紧密黏附，并长期保持，在减少角膜瘢痕形成，促进角膜上皮和基质伤口愈合方面表现出优越的性能。

图5.水凝胶在兔角膜缺损处的体内应用。(A)将水凝胶注射到角膜缺损处。分别使用(B)C3H1水凝胶、(C)1%HAMA水凝胶和(D)3%pDCSM-G水凝胶处理后的代表性裂隙灯照片(左)和AS-OCT图像(右)。

图6.水凝胶处理的角膜术后观察。(A)兔实验眼在不同时间点填充C3H1和1%HAMA水凝胶后，钴蓝荧光素染色的代表性照片。角膜中央的绿色区域表示上皮细胞的缺陷。(B)术后4周、8周分别用C3H1水凝胶、1%HAMA水凝胶、3%pDCSM-G填充实验眼和未治疗眼的典型裂隙灯和AS-OCT图像。(C)术后8周C3H1水凝胶填充组角膜基质、视神经和内皮细胞的共聚焦显微镜观察。白色箭头指向后基质的视神经。

图7.术后8周水凝胶处理兔角膜的组织学分析。有代表性的(A)无缺陷的天然角膜，(B)有未经处理的缺陷的角膜，以及(C)1%HAMA水凝胶，(D)3%pDCSM-G，和(E)C3H1水凝胶的有代表性的H&E图像。根据H&E染色结果对(F)上皮厚度和(G)基质厚度进行定量。使用生物标记物α-SMA(绿色)和DAPI(蓝色)，免疫荧光染色的代表性图像：(H)无缺陷的天然角膜，(I)有未经处理的缺陷的角膜，以及(J)1%HAMA水凝胶，(K)3%pDCSM-G和(L)C3H1水凝胶填充的有缺陷的角膜。(*P<0.0001)。

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结论

该研究研制了一种由pDCSM-G和HAMA组成的化学双交联水凝胶，可以方便地填充到角膜缺损处进行无缝修复，避免了侵入性手术和与供体角膜移植或预成型水凝胶植入相关的并发症。其pDCSM-G组分表现出良好的生物学性能，而HAMA的组成提高了机械强度和稳定性。该水凝胶具有良好的物理性能，包括透明度高，溶胀小，降解缓慢，机械性能强。此外，由于形成了相互渗透的网络和对邻近组织稳定的酰胺键，这种杂化水凝胶表现出良好的密封性能，实现了无缝连接。作为一种填充生物材料和生物活性密封剂，双交联型杂化水凝胶在未来的生物医学应用中对角膜缺损的长期修复具有很大的前景。

来源：眼科材料前沿