Lgr5细胞在维持软骨细胞特性中的作用

撰文 | 存中一贯

骨骼的活动能力主要依赖于滑膜关节，它由连接相邻骨骼的关节软骨组成。骨关节炎（Osteoarthritis,OA）会导致进行性滑膜关节退化、疼痛以及功能失调等【1】。衰老和创伤是OA发生的主要风险因素，OA是导致老年人残基的主要原因。OA患者大约有5亿人，然而，目前针对OA的治疗方法仅为姑息治疗或者侵入性手术【2】，微创以及能够改善疾病的药物仍然是OA治疗的急切需求。

成年人关节软骨中不存在血管和循环祖细胞，细胞总数量和重塑能力受到限制【3】。软骨细胞（chondrocytes）是关节软骨中成熟的骨骼细胞类型，定植在胞外基质（extracellular matrix,ECM）中间，并进行较低程度的无氧代谢，维持ECM的最低更新【4】。OA的一个显著特征是对骨骼组织平衡的破坏，骨骼细胞偏向分解代谢【5】，此时，软骨细胞开始表达一些骨骼细胞发育以及成骨细胞分化相关基因，比如RUNX2以及osteocalcin（OCN）等。骨关节炎中的软骨细胞表现出较强的无氧代谢，促进成骨细胞分化和骨形成，并引起软骨细胞坏死等。尽管维持软骨细胞的特征对于骨骼组织平衡非常重要，但对于OA患者来说，重建软骨细胞特征在临床上并不成功。

在骨骼祖细胞中，经典Wnt（canonical Wnt, cWnt）信号通路在一定程度上能够决定软骨细胞和成骨细胞之间的命运转换，对于软骨细胞表型特征维持非常重要【6】。在肢体发育和骨折愈合过程中，经典的β-catenin能够驱动骨骼祖细胞向成骨细胞发育，而敲除β-catenin则导致骨骼祖细胞向软骨细胞发育【7】。因此，cWnt抑制性环境对于维持软骨细胞特征是非常重要的，而OA软骨细胞中额外表达的cWnt则促进了软骨细胞的炎症反应、衰老、肥大以及向成骨细胞的分化【8】。目前，关节软骨如何维持cWnt的低水平生态位还是未知。

近期，来自美国哥伦比亚大学欧文医学中心的Mildred C. Embree课题组在Cell Stem Cell发表了文章Lgr5-expressing secretory cells form a Wnt inhibitory niche in cartilage critical for chondrocyte identity，他们利用颞下颌关节（temporo-mandibular joint,TMJ）模型对关节组织中低cWnt生态位产生的原因进行了详细的研究，发现位于软骨膜（perichondrium,PC）表面（superficial zone, SZ）的Lgr5表达细胞在维持低cWnt水平的过程中发挥了重要作用。

研究人员在尤卡坦小型猪（Yucatan miniature pigs）中通过手术在颌关节锥面打孔，成功构建了继发性创伤后OA模型，并分析了创伤面和邻近健康骨骼组织的转录组数据。结果显示，在创伤骨骼组织中下调的基因涉及线粒体能量代谢和氧化磷酸化，说明软骨细胞开始转向无氧代谢。同时，上调的基因与ECM降解、炎症反应、骨骼发育、成骨细胞分化、骨骼矿化等生理过程相关。体外踝突细胞系（condylar chondrocytes, CCs）以及颈周细胞系（perichondial cells, PCs）体外实验显示，Wnt信号通路激活促进了成骨细胞分化，而抑制Wnt信号通路则促进了软骨细胞稳定，上述结论在Prg4-/- OA小鼠模型中也得到验证。

Lgr5是一个Wnt靶基因，在胃肠道中Lgr5主要表达在一类分泌型细胞中。研究人员发现，在颌关节中也有表达Lgr5的细胞存在，具体情况为，E14.5天时，Lgr5表达细胞主要分布在踝胚基（condylar blastema, CB）的表面，环绕着Meckel’s软骨和中耳骨。在E16.5天上关节腔（superior joint cavity, SJC）形成时，Lgr5表达在椎间盘祖细胞中（disc progenitor cells, DPCs）。而当第E18.5天和P0天下关节腔（inferior joint cavity, IJC）形成时，Lgr5表达在椎间盘细胞中，但却严格限制在外层SZ区域。进一步的分析显示Lgr5表达的细胞与周围的CPCs细胞以及软骨细胞都存在很大差异，这种细胞既不表达Sox9和Runx2，也不表达ACAN和COL2A1。同时，在衰老的过程中以及OA小鼠模型中，Lgr5的表达都是降低的，这说明Lgr5的表达下调可能促进了OA的进程。

研究人员构建了Prg4-/-小鼠与Wnt报告小鼠的杂交鼠，发现CPCs细胞维持了低cWnt环境，而在杂合小鼠中，Lgr5表达的丧失与cWnt的激活同时发生，这说明Lgr5表达的细胞能够调控cWnt的活性，Lgr5的表达维持了低cWnt活性。进一步的实验表明，在E13.5和E15.5天时通过白喉毒素（diphtheria toxin, DT）敲除Lgr5表达的细胞能够影响踝胚基的形成，而在E17.5天时通过DT敲除Lgr5表达细胞则对TMJ的发育没有太大影响，说明Lgr5表达的细胞对TMJ发育的影响主要是在早期阶段。

研究人员推测，Lgr5表达细胞对低cWnt环境的作用可能是通过调控Wnt抑制因子Dkk3的表达来实现的。研究人员发现Dkk3的表达与Lgr5的表达存在共定位，敲除Lgr5表达细胞同样导致了Dkk3表达的下调，证明了研究人员的推测。此外，研究人员还发现Lgr5表达的细胞通过促进DKK3和SOST的表达为软骨细胞提供了一个低cWnt生态位。

基于上述结果，研究人员发展了一种新的治疗策略StemJEL，这是一种可注射的水凝胶疗法，在2%的透明质酸内包被了SOST重组蛋白，使其能够在骨骼中持续释放，进而抑制cWnt活性。之后，通过实验发现，StemJEL能够显著降低cWnt活性，降低RUNX2的表达，在人体细胞以及OA病理细胞中也得到了类似的结果。最后，研究人员在兔子TMJ OA模型中对StemJEL的作用进行了检测，发现StemJEL促进了软骨力学和组织学的完整性，降低了Wnt信号，促进了软骨特征的维持等。在另外一种兔子前交叉韧带切断模型（anterior cruciate ligament transection, ACLT）中，StemJEL处理显著促进了兔子的跑动时间，通过抑制Wnt活性显著改善了OA带来的膝盖关节损伤。

总之，本研究发现关节中Lgr5表达细胞维持的低cWnt生态位对于软骨细胞特征维持非常重要，骨关节炎的发生与Lgr5表达受损、无法维持低cWnt环境有关，最终导致软骨细胞向成骨细胞的分化，破坏软骨细胞平衡。研究人员开发了一种新的治疗策略StemJEL，在OA动物模型中表现出了良好的治疗效果，未来有望成为骨关节炎治疗的新方法。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2023.08.004

制版人：十一

参考文献

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2. Hunter, D.J., and Bierma-Zeinstra, S. (2019). Osteoarthritis.Lancet393, 1745–1759.

3. Huey, D.J., Hu, J.C., and Athanasiou, K.A. (2012). Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.Science338, 917–921.

4. Heinemeier, K.M., Schjerling, P., Heinemeier, J., Møller, M.B., Krogsgaard, M.R., Grum-Schwensen, T., Petersen, M.M., and Kjaer, M. (2016). Radiocarbon dating reveals minimal collagen turnover in both healthy and osteoarthritic human cartilage.Sci. Transl. Med.8, 346ra90.

5. Hunter, D.J., March, L., and Chew, M. (2020). Osteoarthritis in 2020 and beyond: a Lancet Commission.Lancet396, 1711–1712.

6. Zhou, Y., Wang, T., Hamilton, J.L., and Chen, D. (2017). Wnt/beta-catenin signaling in osteoarthritis and in other forms of arthritis.Curr. Rheumatol. Rep.19, 53.

7. Hill, T.P., Sp€ater, D., Taketo, M.M., Birchmeier, W., and Hartmann, C. (2005). Canonical Wnt/beta-catenin signaling prevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes.Dev. Cell8, 727–738.

8. Mizuhashi, K., Ono, W., Matsushita, Y., Sakagami, N., Takahashi, A., Saunders, T.L., Nagasawa, T., Kronenberg, H.M., and Ono, N. (2018). Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.Nature563, 254–258.