《ACS Nano》多功能微凝胶乳膏水凝胶预防术后腹腔粘连

(Bo Liu,Yunfan Kong,Olawale A, et al. Multifunctional Microgel-Based Cream Hydrogels for Postoperative Abdominal Adhesion Prevention ACS Nano,2023, 17(4): 3847-3864)

术后腹腔粘连是手术后的常见问题，90%的患者在腹腔手术后发生腹腔粘连，并诱发一系列并发症。目前的抗粘连策略主要是药物治疗和物理屏障材料。药物治疗包括局部或全身性抗炎药和抗凝剂（如阿司匹林、地塞米松和肝素），但是它们并不能够有效预防腹腔粘连。物理屏障材料作为抗粘连处理更加方便和有效。然而，市售的薄膜屏障存在种种缺点。本文章设计的可注射乳膏状水凝胶，拥有快速凝胶、自愈合、抗氧化、抗炎和抗细胞粘附等众多功能于一体，它是由苯硼酸（PBA）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和透明质酸（HA）以及微凝胶与基于动态硼酸酯键的聚乙烯醇（PVA）偶联反应快速形成多功能水凝胶。

首先合成了苯硼酸（PBA）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）配合物，然后通过透明质酸（HA）和PBA-EGCG配合物生成HA-PBA-EGCG（HPE）微凝胶。通过将HPE微凝胶与聚乙烯醇（PVA）混合，在硼酸和1，3-二醇基团之间形成硼酸酯动态键，合成了多功能水凝胶（HPE-PVA）。HA是一种天然的胺聚糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，在临床应用中已被用作抗粘连屏障。EGCG是绿茶中含量最丰富的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、杀菌、促血管和抗癌作用。

方案1 多功能乳膏HPE-PVA水凝胶制备方案.B 小鼠盲肠-腹壁粘附模型示意图。

H1PE微凝胶显示粒径为在200至1000 nm之间（图1A）,HhPE微凝胶粒径平分布范围为200至900 nm之间（图1B）。H1PE和HhPE微凝胶的zeta电位分别为-30和-41 mV（图1C）。为了进一步探究HlPE和HhPE的生物相容性，对L929成纤维细胞的增殖没有明显影响（图1D E）。此外，H1PE和HhPE微凝胶血液相容性低于1%（图1F），上述所有结果表明，HPE微凝胶具有微粒结构和良好的细胞和血液相容性。

图1 H1PE和HhPE微凝胶的形态、大小分布、细胞毒性和溶血。

可注射的含儿茶酚水凝胶是在HPE微凝胶和PVA之间的硼酸酯动态共价键的基础上制造的（方案1和 图2 A ），HlPE和HhPE微凝胶可以重悬于水中，形成乳白色乳液。在水中完全平衡后，使用200 μL移液器吸头将HPE微凝胶与PVA混合。乳膏水凝胶在室温下约10秒后形成（图2B）。对所形成的样品进行SEM表征，并观察到与微粒高度多孔和相互连接的结构（图2C）。微粒的多孔结构可以保证附着在目标组织上并逐渐降解凝胶。食用色素染料（红色和蓝色）混合的水凝胶可以很容易地通过胰岛素针（29 G）注射，然后，两块水凝胶（红色和蓝色）在相互接触50 S后可以自我修复（图2D）。在体外评估了PBS中HPE-PVA水凝胶的降解曲线。由于可逆硼酸酯键，水凝胶的质量随着孵育时间的增加而逐渐减少（图2E）。HhPE-PVA降解速率比HlPE-PVA降解速率要慢这可归因于具有高分子量HA的水凝胶网络的增强交联密度。通过流变测试进一步表征了乳膏水凝胶的粘弹性，以评估HPE-PVA水凝胶的注射性和自修复行为（图2F-I）。

图2 HPE-PVA水凝胶的形态、流变特性和生物降解性。

图3 HPE-PVA水凝胶的细胞相容性、血液相容性和抗细胞粘附性。

由于HPE-PVA水凝胶含有游离酚基团和动态硼酸酯，水凝胶表现出良好的抗氧化能力。采用ROS清除试验和DPPH自由基清除试验研究了HPE-PVA水凝胶的体外抗氧化能力。将HPE-PVA水凝胶与过氧化氢（H2O2）共培养，可以刺激细胞产生过多的细胞内ROS。H2DCFDA作为探针检测氧化后的细胞内ROS水平（图4A），DCF荧光信号强度的定量分析表明，HPE-PVA水凝胶可以显著降低细胞内ROS（ 图4 B ）。此外，为了测试自由基清除特性，将HPE-PVA水凝胶在DPPH溶液中孵育。结果发现（图4C）HhPE-PVA水凝胶显示出比HlPE-PVA更高的DPPH清除效率（超过90%）。促炎M1巨噬细胞，以评估HPE-PVA水凝胶在体外的抗炎作用。如图 4 D 所示，qPCR分析表明，经LPS/IFN-γ激活后，HhPE-PVA水凝胶处理的M1巨噬细胞的组织坏死因子（TNF）-α和NF-κB表达均显著上调（ 图4 E ，F）。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）进一步测量了M1巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-1β。结果发现，刺激后TNF-α和IL-1β显著升高，而HPE-PVA水凝胶处理后促炎细胞因子分泌物显著减少（ 图4 G ，H）。这些结果表明，HPE-PVA水凝胶通过下调促炎因子和细胞因子分泌物来起到抗炎作用。

图4 HPE-PVA水凝胶的抗氧化和抗炎作用。

使用小鼠盲肠-腹壁粘附模型来评估HPE-PVA水凝胶预防术后盲肠-腹粘连的能力，分别与商业Seprafilm材料和未处理的小鼠进行比较。粘连形成的图像（图5A）以及所有组均在术后第14天进行打分（图5B）。仅受伤组在腹壁和盲肠之间显示出严重的粘连。商业Seprafilm膜组中的粘附位点可以被清楚地观察到。这表明Seprafilm只能在一定程度上降低术后粘连，整体效果并不理想，并且HlPE-PVA组也减轻了粘附。HhPE-PVA处理组几乎没有产生粘连现象，这表明粘连得到了有效预防。组织染色同样证实这一点（图5C-D）。

图5 HPE-PVA水凝胶在小鼠盲肠-腹壁粘附模型中的抗粘附效率。

为了进一步研究PHE-PVA水凝胶的抗炎和抗氧化作用，我们使用qPCR，免疫荧光（IF）染色和蛋白质印迹方法进行了分子生物学研究。与Sham组相比，仅损伤组的手术创伤显著增加了诱导性iNOS，TGF-β1，TNF-α和IL-6的促炎基因表达（图6A-D）。 用 HhPE-PVA 治疗与仅损伤组相比，iNOS基因表达显着下调，而HlPE-PVA水凝胶和Seprafilm组只能略微降低iNOS基因表达，没有统计学差异（图6A）。图6B-D显示，所有治疗组的TGF-β1、TNF-α和IL-6基因均显著下调，HhPE-PVA水凝胶具有最好的功效，荧光同样证实了这一点（图6E-F）。与损伤组相比，HPE-PVA水凝胶和sepilfilm处理组均降低了iNOS/DAPI比率（图6G）。HhPE-PVA组也显著降低了这一比例，这表明以上三组表现出抗炎作用。还比较了不同组CD68/DAPI的荧光面积比(图6H)，与上述结果一致。损伤组两种促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的蛋白表达与预期一致（图6J）。三组实验组均降低了这两种促炎因子的表达，且HhPE-PVA水凝胶组对抗炎因子抑制效果最明显。还用DHE研究了HPE-PVA组的体内抗氧化作用（图6I）。

图6 HPE-PVA水凝胶对体内氧化应激和炎症的影响。

纤维降解和沉积之间的不平衡诱导了术后粘连的形成,t-PA是纤维蛋白溶解的关键介质，而PAI-1是tPA的主要抑制剂，可降低纤维蛋白溶解活性。qPCR结果显示，不同组tPA的表达相当，无显著差异（图7A），仅受伤组的PAI-1水平显着上调,蛋白质印迹和IF染色结果证实，所有五组之间的tPA蛋白表达没有差异（图7A，D，E）。

图7 HPE-PVA水凝胶对纤维蛋白溶解活性的影响。

使用蛋白质组来检查和比较差异蛋白表达谱。主成分分析（PCA）显示，对照组可以与仅损伤组和Seprafilm组明显区分（ 图8 A ），并对6603种蛋白质进行了分析，有2882种在所有四组中表达，而109和316种蛋白质分别在对照组和损伤组中唯一表达（ 图8 B ）。与HhPE-PVA组相比，损伤组有486个蛋白上调，48个蛋白下调（图8D）。在上调的蛋白中，S100A8和S100A9蛋白（calgranulin A和B）已被报道是Ca2+结合蛋白，在许多炎症细胞中有所表达。如图8E、F所示，损伤组S100A8和S100A9的表达明显升高，而经HhPE-PVA水凝胶处理后，S100A8和S100A9的表达明显降低（图8GH）。

图8.使用蛋白质组学分析差异蛋白表达谱。

总结：

多功能HPE-PVA乳膏水凝胶是通过HPE微凝胶与PVA之间的动态硼酸酯共价键合成，本文证明其具有快速凝胶、自修复、抗氧化、抗炎和抗细胞粘附等多种功能；与Seprafilm处理组相比， HhPE-PVA水凝胶能够显著减少腹部粘连的形成，进一步通过蛋白组学分析表明，其抗黏附形成可能与调控S100A8和S100A9的表达有关。综上所述，本文制备的多功能水凝胶展示了其在预防术后粘连方面的临床应用潜力。

全文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsnano.2c12104