天津工生所开发维生素B12无细胞合成平台，涉及36个酶

维生素 B12（钴胺素）是高等动植物生理活动必需的化合物。它以辅酶形式在 DNA 合成、甲基化和线粒体代谢中发挥重要作用，是大脑和神经细胞功能和发育的关键参与者。

从结构上来说，维生素 B12 由含钴咕啉环、上下配体组成。依据上部配体的不同，可以分别产生 5'-脱氧腺苷钴胺素（AdoCbl）、甲基钴胺素（MeCbl）、羟钴胺素（OHCbl）和氰钴胺素（CNCbl）。MeCbl 和 AdoCbl 是维生素 B12 的天然生物活性形式，而 CNCbl 是工业生产的稳定形式，OHCbl 是 AdoCbl 中 Co-C 键断裂后产生的水合物。

由于维生素 B12 结构复杂，化学合成产量低，因此大规模的维生素 B12 工业生产依赖于微生物发酵。然而，无论是工业菌株还是工程菌株，在发酵过程或菌株进化方面都存在缺陷，因此需要探索和分析合成途径，并创新合成方法。

无细胞多酶催化是绿色生物制造领域的新兴技术之一，也是代谢工程的新兴替代方案。该技术通过设计和构建新的多酶合成路线，使得一些从天然途径难以获得的化学品的生产成为可能。级联催化与微生物发酵相比具有明显的优势，比如中间体和产物的有效分离和纯化，对有毒中间体化合物的高耐受性，以及高滴度、收率和生产率。

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所团队在维生素 B12 生物合成技术开发方面取得新进展。研究人员通过将微生物 B12 合成途径中 24 步催化反应进行模块划分，构建了体外无细胞催化合成微生素 B12 的技术体系，并实现了体外多酶催化体系中产量的较大提升。相关文章以题“A synthetic cell-free 36-enzyme reaction system for vitamin B12 production”发表于Nature Communications。该团队由张大伟研究员领导。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院青年创新促进会和天津市合成生物技术创新能力提升行动的支持。

（来源：Nature Communications）

钴胺素的合成途径复杂，涉及数十个反应步骤和化合物，因此它的无细胞合成一直难以实现，并且仅报道了少数通过酶级联合成的中间体。

在这项研究中，研究人员成功重组了一个无细胞合成平台，以 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）作为底物合成 AdoCbl。整个合成途径，包括由 36 个酶催化的 32 个总体步骤，以及由再生模块中另外 10 种酶催化的 8 个再生反应。

▲图丨AdoCbl 合成途径示意图（来源：Nature Communications）

整个途径分为五个合成模块和五个辅因子再生模块。

在Precursor 模块中，Precorrin-2 由 HemB、HemC、HemD 和 CobA 使用 5-ALA 作为底物合成，从而组装中心卟啉环。

HBA 模块负责对卟啉环前体进行一系列修饰以产生 HBA。

在AdoCby 模块中进行进一步的酰胺化和上部配体组装，包括酰胺化、钴螯合反应、钴还原和腺苷酸化反应，从而从 HBA 生产 AdoCby。

然后，来自 5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）的核苷酸环被组装为AdoCbl 模块中 AdoCby 的配体，从而合成 AdoCbl。

研究人员对每个合成模块分别执行设计-测试-优化循环。包括解决副产物反馈抑制现象，解决腺苷钴啉胺酸（AdoCby）合成模块的中间产物检测难问题。

此外，该工作还通过构建 AdoCby 及相关中间产物的直接检测方法，实现了模块产物的直接检测；通过分析级联酶促反应间的相互影响，发现了反应途径中 ATP 使用的竞争现象，并通过引入 ATP 再生反应对该现象进行缓解；针对维生素 B12 合成途径中辅因子种类多、数量多的特点，构建了全局辅因子再生系统，实现了体系中辅因子的部分回补，进一步优化与提升催化体系。

最后，对整个合成体系进行重组，以 5-ALA 为底物，得到的 AdoCbl 含量为 417.42μg/L。研究人员还针对由 HBA 生产 AdoCbl 的无细胞反应体系进行了优化，最终 AdoCbl 滴度在 14h 内达到 5.78mg/L，与初始反应体系相比显著提高，超过了原反应体系。

研究人员指出，就滴度和生产率而言，无细胞合成维生素 B12 有可能与细菌发酵竞争。此外，无细胞系统可以绕过困难且耗时的基因工程，直接操作酶、辅助因子和缓冲液，缩短了优化周期。不过，就投入产出比而言，由于蛋白质纯化和辅助因子消耗的成本较高，无细胞合成系统目前与细菌发酵相比并不具有优势。不过，通过固定化或创新共纯化工艺来提高酶的活性，可以大大降低蛋白质纯化的成本，使无细胞合成系统在投入产出比和工业应用方面与细菌发酵系统相比更具竞争力。

总的来说，该研究实现了以 5-ALA 为底物合成维生素 B12 的体系构建，以及以 HBA 为底物合成维生素 B12 的催化体系的产量提升。该研究对构建长途径、多元素的复杂无细胞合成体系具有一定的指导意义。

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