复方1区-含药血清：多组学揭示四君子汤通过调节氧化磷酸化改善胃癌前病变

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导读

四君子汤（SJZD）是临床上常用的治疗胃癌前病变（GPL）的中药方剂，目前不完全清楚四君子汤的胃保护机制。本研究旨在系统评价SJZD阻断GPL发展的疗效，并揭示其潜在机制。首先，我们建立了大鼠GPL模型，该模型由N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）联合不规则饮食和40%酒精诱导。然后，基于稳定同位素二甲基标记的定量蛋白质组学揭示了SJZD的药效机制。同时，通过定量代谢组学验证了其药效机制。此外，通过血清药理学方法在细胞模型中证实了SJZD的抗胃炎作用，并进一步验证了其作用机制。结果证明SJZD可以阻断GPL在动物模型中的发展。蛋白质组学和代谢组学显示SJZD通过调节氧化磷酸化（OXPHOS）阻断GPL的发育。此外，血清药理学结果表明，含SJZD的血清（SJZD-CS）可抑制MNNG诱导的GES-1细胞凋亡 。OXPHOS抑制剂可显著降低SJZD-CS的保护作用。SJZD有效改善GPL，蛋白质组学和代谢组学揭示其保护作用与OXPHOS密切相关。

论文ID

原名：Sijunzi decoction ameliorates gastric precancerous lesions via regulating oxidative phosphorylation based on proteomics and metabolomics

译名：基于蛋白质组学和代谢组学揭示四君子汤通过调节氧化磷酸化改善胃癌前病变

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2023.07

通讯作者：戴建业

通讯作者单位：兰州大学药学院

实验设计

实验结果

1. SJZD能显著改善MNNG联合酒精和不规律饮食诱导的GPL

我们采用 N- 甲基 -N′- 硝基 -N- 亚硝基胍（ MNNG ）联合酒精和不规律饮食诱导的 GPL 模型来评价 SJZD 的疗效。处理 20 周后，从动物身上采集胃组织和血清，观察病理切片并分析生化指标。两组之间的体重没有显著差异（图 1A ）。 HE 染色显示，模型组肌肉层炎症细胞和肥大细胞浸润增加，腺体肠化生明显。在给予维生素辅酶和 SJZD 后，上述这些指标都被恢复（图 1B ）。进一步分析血清生物标志物超氧化物歧化酶（ SOD ）、乳酸脱氢酶（ LDH ）和谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-Px ）。 SJZD 处理后， SOD 和 GSH-Px 水平显著升高， LDH 水平降低（图 1C–E ）。 LDH 是糖酵解过程中丙酮酸转化为乳酸的关键酶，为肿瘤生长提供能量。超氧化物歧化酶调节细胞产生的超氧化物和过氧化氢水平，进而调节细胞信号传导。 GSH-Px 通过将氢和有机过氧化物的还原与谷胱甘肽（ GSH ）氧化为谷胱甘肽二硫化物（ GSSG ）相结合来保护细胞免受氧化应激。生物标志物丙二醛（ MDA ）和肌酸激酶（ CK ）的结果如图 S1A 和 B 所示。

图1 SJZD治疗胃癌前病变的疗效

（A）实验动物的体重变化曲线没有显著差异。（B）胃组织HE染色显示SJZD具有良好的抗GPL作用。（C）SJZD改善GPL疾病模型中血清SOD水平的下降。（D）SJZD改善GPL疾病模型血清LDH水平的升高。（E）SJZD改善了GPL疾病模型血清GSH-Px水平的下降。与对照组相比，* P  <  0.05，** P < 0.01，*** P  <  0.001。与模型组相比，# P  < 0.05，## P  <  0.01，### P  <  0.001（n  =  6）。

2. 定量蛋白质组学揭示SJZD的药效机制

基于稳定同位素二甲基标记的定量蛋白质组学分析，通过鉴定三组中差异表达的蛋白质，我们探索 SJZD 的药效机制（对照组、模型组、 SJZD 高剂量组， n =  每组 6 只大鼠）（图 2A ）。选择模型组与对照组筛选的 157 种差异表达蛋白和 SJZD 组与模型组筛选的 187 种差异表达蛋白质进行后续分析（图 2B ）。模型组中受影响的信号通路、分子功能、生物过程和细胞成分（图 2C 和 D ）在 SJZD 治疗后恢复（图 2E 和 F ）。由于炎症伴随氧化应激是 GPL 发展过程中胃粘膜损伤的关键原因，氧化磷酸化（ OXPHOS ）是我们关注的焦点。此外，我们构建了蛋白质 - 蛋白质相互作用网络，大多数具有较高自由度的蛋白质与 OXPHOS 相关（图 S2A 和 B ）。总之，我们的数据表明， SJZD 通过调节 OXPHOS 对 GPL 的发展发挥保护作用。

图2 SJZD的定量蛋白质组学实验结果

（A）定量蛋白质组学的流程图。（B）模型组和SJZD治疗组差异蛋白的维恩图。（C，D）模型组（与对照组）中干预的差异蛋白的KEGG和GO分析。（E、F）SJZD处理组（与模型组）中恢复的差异蛋白的KEGG和GO分析。

3. 定量代谢组学显示SJZD通过调节氧化磷酸化而有效

为了验证 SJZD 是否通过调节 OXPHOS 发挥其药用作用，我们进行了定量代谢组学分析，以揭示 SJZD 治疗后胃组织中的代谢产物。我们在对照组、模型组和 SJZD 组中测定了 221 种代谢物（图 S3B ）。进行主成分分析（ PCA ）以证明各组之间的差异。 SJZD 治疗后观察到显著的回归（图 3C ）。氨基酸、脂肪酸和有机酸的丰度在三组之间存在显著差异（图 S3C ）。差异代谢产物的 KEGG 分析显示，模型组中受影响的大多数代谢途径在 SJZD 治疗后恢复（图 3A 和 B ）。此外，在模型组中，葡萄糖水平降低，乳酸和丙酮酸水平（糖酵解）增加（图 3D ），柠檬酸水平（三羧酸 [TCA] 循环）增加，富马酸水平和富马酸与琥珀酸的比例降低（图 3E ）。用 SJZD 治疗后，胃组织中的糖酵解减少， TCA 循环恢复（图 3D 和 E ）。线粒体内膜可以选择性地协调 OXPHOS 相关代谢产物的运输。 SJZD 治疗后，苹果酸、天冬氨酸、肉碱和瓜氨酸的异常转运得以恢复（图 3F ）。结合蛋白质组学和代谢组学结果，我们得出结论， SJZD 可能通过调节线粒体中的 OXPHOS 来阻断 GPL 的发展。

图3定量代谢组学实验结果

（A）KEGG代谢途径干预模型组（vs对照组）。（B）KEGG代谢途径干预SJZD治疗组（vs模型组）。（C）对照组、模型组和SJZD治疗组的PCA分析。（D）葡萄糖、乳酸和丙酮酸水平的变化被用来表明SJZD对于糖酵解的抑制（n = 4）。（E）柠檬酸、富马酸水平的变化以及富马酸与琥珀酸的比例被用来指示SJZD对TCA的激活（n =  4）。（F）线粒体运输的OXPHOS相关代谢产物苹果酸、天冬氨酸、肉碱和瓜氨酸水平升高（n = 4）。与对照组相比，* P  <  0.05，** P < 0.01，*** P  <  0.001。与模型组相比，# P  <  0.05，## P  <  0.01，### P  <  0.001。

4. 血清药理学证实SJZD可通过OXPHOS改善MNNG诱导的GES-1 细胞凋亡

为了证实 SJZD 通过调节 OXPHOS 发挥其作用， MNNG 诱导的 GES-1  细胞被用作 GPL 的细胞模型。 CCK8 、台盼蓝染色和吉姆萨染色实验表明，含有 SJZD 的血清（ SJZD-CS ）可以减少 MNNG 对 GES-1 细胞的损伤   （图 4A–D ）。 IACS-010759 是 OXPHOS 复合物 I 的抑制剂。 IACS-010759 处理后 SJZD-CS 对 MNNG 损伤 GES-1 细胞的保护作用明显减弱。因此， SJZD 可以通过激活 OXPHOS 途径发挥其药用作用（图 4E ）。

图4 SJZD-CS可抑制MNNG诱导的GES-1细胞的细胞凋亡

（A）CCK8检测SJZD-CS对MNNG所致GES-1细胞损伤的保护作用。（B）台盼蓝计数法检测SJZD-CS对MNNG所致GES-1细胞损伤的保护作用。（C–D）吉姆萨染色检测SJZD-CS对MNNG诱导的GES-1细胞损伤的保护作用。（E）CCK8检测到IACS-010759减弱SJZD-C的疗效。（F）BV2的细胞凋亡检测SJZD-CS处理的MNNG诱导的细胞。数据以平均值表示± SD中，* p <  0.05，** p  <  0.01，*** p  <  0.001，n  =每组3个。

流式细胞术用于检测细胞凋亡。我们发现 SJZD-CS 可以显著抑制 MNNG 诱导的 GES-1 细胞凋亡   。此外， CCK8 和台盼蓝染色实验表明， SJZD-CS 可以通过增加 ROS 水平来降低人胃腺癌细胞的存活率（图 S4D-F ）。 ROS 主要由线粒体呼吸链的复合物 I 和复合物 III 产生， ROS 的增加与 OXPHOS 的激活有关。

癌症难以完全治愈，发病率高。癌症的发生与人们不良的饮食习惯密切相关。除了饮食中感染幽门螺杆菌外，腌制食品中的 N- 亚硝基化合物、过量饮酒和不规律饮食都会导致 GPL 并引起癌症的发生。近年来，中医药已被广泛应用于恶性肿瘤的治疗。因此，从中医学角度研究预防和治疗癌症的策略是可行的。

SJZD 是一种常用于临床治疗胃肠道疾病的中药配方。有两种用药方式，一种是以人参为主要药材（君药），另一种以党参为主要药材（君药）。作为君药。党参在临床实践中经常在 SJZD 配方中使用以治疗 GPL 。这可能是由于党参与人参配方相比，该 SJZD 配方能够极大地清除具有直接细胞毒性的自由基，自由基会对胃黏膜造成严重损伤。此外，党参的市场价格比人参低很多。我们之前的研究也表明，党参对氧化应激损伤具有保护作用，并降低 LDH 水平， LDH 促进肿瘤发展，调节 GPL 发展过程中的能量代谢。因此，我们推测党参在 SJZD 治疗 GPL 中发挥重要作用。此外，其他三种中草药在治疗胃部疾病方面也具有药理作用。白术可以通过干扰白细胞介素 17 信号通路来保护胃肠道，茯苓通过糖皮质激素受体介导的 PI3K/Akt/NF-κB 改善肠道屏障功能，以及甘草可通过清除氧自由基和作为抗炎剂用于治疗胃肠道疾病。然而， SJZD 的具体药效机制尚未得到很好的研究，限制了 SJZD 在临床上的应用。

我们分析了影响 GPL 发展的因素，并建立了动物模型来研究 SJZD 的药理机制。血清分析显示，模型组中 LDH 水平升高，我们推测这促进了细胞质中的有氧糖酵解，从而减少了丙酮酸进入 TCA 循环（图 1D ）。 SJZD 治疗后 LDH 水平的显著降低可能会改变能量代谢，抑制有氧糖酵解，从而通过 OXPHOS 途径产生能量（图 3D 和 E ）。这与我们的代谢组学结果一致。我们的数据表明， SJZD 通过调节 OXPHOS 发挥其药用作用（图 5 ）。

图5 SJZD通过OXPHOS抑制GPL的机制示意图

OXPHOS 是细胞中 ATP 的主要来源。然而，与主要通过线粒体 OXPHOS 获得 ATP 的正常细胞不同，癌症细胞中 ATP 的主要来源是糖酵解途径，这被称为 “Warburg 效应 ” 。这是因为糖酵解过程中产生的缺氧微环境更有利于癌症细胞的增殖。在 GPL 的发展过程中，含有许多糖蛋白的胃粘膜首先受到损伤。此外，粘膜中线粒体呼吸复合体 I 的水平和细胞呼吸能力降低，限制了线粒体 ATP 的产生和对粘膜滋养层分泌功能的能量支持。下调的 OXPHOS 蛋白 UQCRQ 、 NDUFB7 和 UQCRC2 在胃癌细胞中的高表达与较好的预后呈正相关。这些研究都表明 GPL 的发展与 OXPHOS 通路密切相关。

NADH 的过度积累不仅通过影响 OXPHOS 途径导致能量代谢的改变，而且还会对身体造成严重损伤。例如，过量的电子供应导致高 NADH/NAD+ 比率，从而导致线粒体功能障碍，这是代谢性疾病的一个特征。与此同时，研究人员还发现，过量的 NADH 会导致氧化应激，加剧对身体的氧化损伤。线粒体蛋白质含量的降低不仅与能量代谢有关，还可能导致线粒体介导的细胞凋亡。研究证实，在 GPL 发展的早期，胃黏膜上皮细胞的凋亡增强，许多药物可以通过抑制胃黏膜上皮的凋亡来保护胃黏膜。例如，茶黄素通过下调有丝分裂激活的蛋白激酶途径，减轻乙醇诱导的氧化应激和胃粘膜上皮细胞凋亡。广藿香精油与陈皮复合物（比例为 1:2 ）可抑制胃黏膜上皮细胞凋亡，修复受损的胃黏膜。

在这项工作中， Ndufa10 的表达在 GPL 组中减少。用于合成 DNA 的鸟苷核苷（ dGTP ）水平的改变促进了细胞凋亡，大多数线粒体 dGTP 通过 Ndufa10 和复合物 I 紧密相连，这证实了 Ndufa110 的缺乏与细胞凋亡密切相关。除了 Ndufa10 与细胞凋亡之间的关系外，与细胞色素 c 有关的 Cox7c 和 Cox7b 可以催化电子从还原的细胞色素 c 转移到氧。我们推测 Cox7c 和 Cox7b 的表达减少可能与细胞色素 c 介导的细胞凋亡有关。细胞水平的凋亡蛋白检测也证实了 MNNG 诱导后凋亡蛋白的表达显著增加，但 SJZD 治疗后凋亡显著抑制，这可能是 SJZD 保护胃黏膜的机制之一。

此外，我们的实验证实， OXPHOS 与 GPL 的发展密切相关， OXPHOS 抑制剂 IACS-010759 显著削弱了 SJZD 的疗效（图 4E ）。因此，我们认为激活 OXPHOS 可能是阻断 GPL 发展的有效措施。然而，尚需进一步研究 SJZD 的特异性活性成分及其确切的药理靶点。

结论

我们的研究结果表明， SJZD 可以激活 OXPHOS 来阻断 GPL 的发展。此外，我们使用 OXPHOS 抑制剂直接证实了 SJZD 的作用机制与 OXPHOS 有关。 SJZD 药效机制的发现为探索中药的作用机制提供了新的参考。调节 OXPHOS 影响能量代谢可为癌症的早期治疗提供新的策略。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123007936?via%3Dihub

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