UCSB杨扬教授课题组8天连发 Nat. Catal.封面/Science：生物催化的最新研究进展

近日，美国加州大学圣巴巴拉分校（UCSB）杨扬教授和匹兹堡大学刘鹏教授合作团队于2023年7月20日和7月27日分别以“Enzyme-controlled stereoselective radical cyclization to arenes enabled by metalloredox biocatalysis”和 “ Stereoselective amino acid synthesis by synergistic photoredox-pyridoxal radical biocatalysis ” 为题在Nature Catalysis和Science上发表了两篇最新研究论文。

前期部分研究简介（Science，23 Dec 2021 ）

Science：利用工程化细胞色素 P450 实现立体选择性原子转移自由基环化作用

2021年12月23日，美国加州大学圣巴巴拉（UCSB）杨扬教授课题组在Science上发表题为 “ Stereodivergent atom-transfer radical cyclization by engineered cytochromes P450 ” 的研究论文，加州大学圣巴巴拉分校（博士后）周奇博士为论文的第一作者，杨扬教授为通讯作者，匹兹堡大学刘鹏教授为共同作者。

该研究成功改造了细胞色素P450用于催化立体选择性原子转移自由基环化反应，通过酶的定向进化，发展了四种细胞色素P450突变体，可以分别控制反应过程自由基关环和碳溴键成键的立体中心，实现了小分子催化剂目前无法完成的对映选择性和非对映选择性的同时控制。该项研究进一步拓展了P450酶的非天然功能，为金属酶催化的不对称自由基反应打开了一扇新的大门。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abk1603

Nat. Catal.封面：改造金属酶实现自由基对芳环体系的不对称加成

通过上亿年的自然进化，自然界演化出极其丰富的天然酶库，然而为人所知并且可以为人类所用的酶催化反应类型却相对局限。发现和改造天然酶的反应活性，从而实现非天然生物催化反应（new-to-nature biocatalysis）在化学和生物合成领域引起越来越多的注意。如何高效控制自由基中间体参与的化学转化的立体选择性一直是合成化学中的挑战。由于蛋白活性空腔中的氨基酸残基和底物之间可能存在的一些弱相互作用，酶催化策略控制自由基反应的立体选择性有其天然的优势。通过定向进化和蛋白工程，可以对潜在氨基酸残基进行改造，从而优化酶的催化活性和选择性。

2023年7月20日，美国加州大学圣巴巴拉分校（UCSB）杨扬教授与匹兹堡大学刘鹏教授合作报道了一种金属氧化还原生物催化（metalloredox biocatalysis）策略，通过对天然细胞色素P450酶的定向进化改造，实现了α-卤代酰胺对芳基体系的不对称自由基加成过程。在Nature Catalysis期刊上以封面文章形式在线发表了题为“Enzyme-controlled stereoselective radical cyclization to arenes enabled by metalloredox biocatalysis”的研究文章。加州大学圣巴巴拉分校杨扬教授和匹兹堡大学刘鹏教授为共同通讯作者，加州大学圣巴巴拉分校（博士后）付文振博士为论文第一作者，刘鹏教授课题组付悦完成了论文的计算部分，UCSB研究生Natalia M. Neris和本科生赵 雲 龙和Benjamin Krohn-Hansen对本课题提供了帮助。该研究工作得到UCSB启动经费和NIH 经费支持。

杨扬教授课题组致力于开发新颖的非天然自由基生物催化策略与方法，在金属酶P450改造中首次实现了不对称原子转移自由基环化反应 (Science 2021, 374, 1612–1616)。本文中作者进一步实现了消旋底物α-卤代酰胺对芳基的对映汇聚性自由基加成，并且两个对映异构体都可以高效合成。同时还实现了消旋α-氯代酰胺的动力学拆分，具有较好的拆分效率 （图1）。

图1. 用于立体选择性自由基环化的金属酶平台。

底物中C-X首先被FeII还原生成碳中心自由基，碳自由基进一步对芳环加成环化得到五元环，生成的芳基自由基在FeIII作用下发生PCET过程得到产物并再生FeII (图1)。作者以消旋1a作为模版底物，通过对P450初始突变体的定向进化，得到了两个最终突变体P450arc1和P450arc2，消旋底物1a可以顺利转化以优秀的收率和对映选择性分别得到产物(S)-2a和(R)-2a (图2)。

图2. 条件筛选。

由于天然酶催化一般具有非常明显的底物特异性（substrate specificity），底物结构的微小改变就可能对酶催化反应的活性和选择性产生很大的影响；但同时酶催化混杂性(enzyme catalytic promiscuity)又为拓展底物适用性提供了可能。作者考察了该酶催化的底物适用性，发现对于酰胺羰基邻位不同取代基、芳基不同吸电子或供电子基团、甲基酯或乙基酯、N-Me或N-Et底物，都具有良好到优秀的反应活性和立体选择性。并且对于间位甲氧基取代的底物，酶催化倾向于产生和传统金属催化相反的区域选择性。该催化过程展现出非常优异的催化活性，TTN最高可达12000 （图3）。

图3. 底物拓展。

进一步对α-氯代酰胺3a做了考察，发现突变体P450arc1和P450arc2 P74G L436R F330V可以分别实现产物(S)-2a和(R)-2a的合成。并且发现突变体P450arc3可以实现消旋底物3a的动力学拆分，以45%的回收收率和94:6 e.r.得到手性(R)-3a（图4）。

图4. P450催化α-氯代底物3a的立体选择性转化。

进一步研究了P450arc酶催化α-溴化物1b和α-氯化物3a的对映汇聚性自由基环化过程，对生成产物和剩余底物的e.r.和转化率的关系进行了仔细分析。如图5a所示，α-溴化物1b在P450arc2的作用下进行反应时，产物2b的e.r.值在整个反应过程中保持恒定（97:3），并且反应的主要对映体产物为(R)-2b。而后随着反应的进行，在回收的底物1b中观察到(S)-1b的逐渐富集，存在较低的底物动力学拆分选择性，S因子很小（1.4±0.1）。因此，虽然(R)-1b相对于其对映体(S)-1b的转化速度更快，但由(R)-1b和(S)-1b衍生的产物2b表现出相同的e.r.值。其次，尽管1b在P450arc1的作用下进行反应时易获得产物(S)-2b（图5b），但(R)-1b的转化速度仍然更快。随着反应的进行，产物2b的e.r.值增加，进而表明反应缓慢的对映体(S)-1b以略高的e.r.值转化为2b。与P450arc2类似，P450arc1对底物也表现出较低的动力学拆分选择性（S因子=1.8±0.1）。有趣的是，α-氯化物3a在P450arc1的作用下进行反应时获得主要对映体产物(S)-2a（图5c），产物2a的e.r.值随着转化逐渐降低，表明反应缓慢的对映体(S)-3a以略低的e.r.值转化为2a，并且对底物也表现出较低的动力学拆分选择性，S因子为3.4±0.5。综上所述，对于所有新开发的对映汇聚式转化生物催化剂，都能以优异的对映选择性将外消旋底物转化为产物；并且作者观测到了在不同突变体P450arc1和P450arc2催化消旋底物的过程中，都存在较低的底物动力学拆分选择性，虽然底物最终都可以完全转化生成手性富集的产物；并且观察到了产物e.r. 的三种不同变化过程，该结果进一步阐释了酶催化过程中对映汇聚性手性控制的复杂性。

图5. P450催化对映汇聚式自由基环化过程的时间过程。

最后，对该催化过程的机理进行了考察，以铁卟啉作为简化催化剂进行了密度泛函理论(DFT)计算：Fe中心在整个催化过程中保持高自旋态（FeII为五线态，FeIII为六线态），FeII通过外层解离性单电子还原C-X键；新生成的自由基加成到芳环上具有相对较高的活化能，使得自由基中间体具有相对较长的半衰期，允许C-C键自由旋转后加成到芳环生成单一手性富集的产物；血红素辅基中的羧酸根可能作为碱促进了最后自由基-极性交叉反应（radical-polar crossover）并进一步降低了该步的活化能，所以自由基加成到芳烃这一步被认为是催化反应的对映选择性决定步骤 （图6）。

图6. 机理研究。

综上，利用金属氧化还原生物催化策略，通过非天然电子转移机制重新利用天然细胞色素P450来催化外消旋α-卤代羰基底物对芳烃的不对称自由基环化反应。值得一提的是，他们基于定向进化获得了一系列工程化P450芳香自由基环化酶：其中P450arc1和P450arc2可促进外消旋α-溴代羰基底物的立体汇聚式转化，而P450arc3则能实现外消旋氯化物的有效动力学拆分。此外，DFT计算研究揭示了自由基-极性交叉步骤的质子耦合电子转移机制，并表明血红素羧酸盐作为碱催化剂的潜在作用。

https://www.nature.com/articles/s41929-023-00986-5

Science：光氧化-吡哆醛协同生物催化高立体选择性合成氨基酸

在过去的几十年里，有机小分子催化剂凭借操作简单、易于获取、价格低廉和环境友好等优势已成为不对称合成研究的热点。2021年，诺贝尔化学奖授予Benjamin List和David W.C. MacMillan，以表彰他们在“不对称有机催化发展”中做出的卓越贡献。受小分子催化的启发，生物催化研究者开始重新利用天然黄素、烟酰胺依赖性酶和金属酶来催化非天然反应，特别是立体选择性自由基介导的转化。鉴于非天然氨基酸（ncAAs）广泛存在于生物活性天然产物、肽类药物和功能性非天然蛋白质中，如何高效立体选择性地构建ncAAs已成为合成化学和合成生物学的主要目标。

美国加州大学圣巴巴拉分校杨扬教授、匹兹堡大学刘鹏教授合作报道了通过光氧化催化与 5′-磷酸吡哆醛（PLP）生物催化的协同合并，开发了一种吡哆醛自由基生物催化方法，用于制备有价值的非典型氨基酸，包括具有立体化学二元或三元结构的氨基酸，而无需保护基团。相关成果以 “ Stereoselective amino acid synthesis by synergistic photoredox-pyridoxal radical biocatalysis ” 为题发表在Science上。 第一作者为州大学圣巴巴拉分校（ 博士后）程磊博士，共同通讯作者为杨扬教授和刘鹏教授。

图 1. 协同光氧化还原-吡哆醛自由基生物催化。

目前，ncAAs的传统化学合成法依赖于繁琐的氨基和羧酸保护基团的安装和去除。相比之下，吡哆醛5′-磷酸（PLP）酶能以优异的化学选择性和立体选择性构建和降解游离氨基酸，因此可作为ncAA合成的生物催化剂并且无需保护基操作。作为一种成员众多的酶家族，PLP依赖性酶具有多样化的结构和功能，并且能通过羰基催化机制催化氨基酸α、β和γ位的C-C和C-杂原子成键反应（图1A）。如果能将酶和小分子催化剂实现的两种不同催化循环相结合，那么就能实现传统酶学和合成化学先前无法实现的活化模式。利用光氧化还原催化和吡哆醛5'-磷酸（PLP）生物催化的协同催化策略，开发了一种吡哆醛自由基生物催化方法来制备有价值的非天然氨基酸，并且无需保护基团即可构建具有两个或者三个立体中心的非天然氨基酸（图1B）。其具体过程如下：首先，可见光照射光催化剂IV生成激发态光氧化剂IV*，IV*和烷基三氟硼酸盐底物I发生单电子氧化生成碳中心自由基VI和还原型光催化剂V。与此同时，PLP依赖性酶VII（如：色氨酸合酶）可通过一系列已确定的天然中间体（VIII-X）将丝氨酸和其它β-羟基-α-氨基酸 II转化为亲电氨基丙烯酸酯X。随后，光催化产生的烷基自由基VI进入活性位点并与生物催化形成的氨基丙烯酸酯X结合，进而产生中间体——酶结合的氮杂烯丙基自由基XI。最后，XI和还原态光催化剂V经电子转移/质子转移（ET/PT）或质子耦合电子转移（PCET）获得外部醛亚胺XII，经水解便可获得氨基酸产物III（图1D）。在吡哆醛自由基生物催化中，III的α位立体化学由ET/PT或PCET步骤控制，因此，通过蛋白质工程就可以获得两种对映体 - L-氨基酸和D-氨基酸（图1C）。

图2. 反应条件优化。

首先选择苄基三氟硼酸盐1a为模板底物对反应条件进行筛选，并得到最佳反应条件：即1a在L-PfPLPβ为生物催化剂（1.0 mol %）、罗丹明B（RhB，10 mol %）为光催化剂于微酸性条件下（pH = 6.0）进行反应时，能以73%的产率和93:7 e.r.值获得C-C键偶联产物L-3a。对照实验表明酶催化剂L-PfPLPβ、光氧化还原催化剂RhB和光源缺一不可，进而说明该反应是双催化过程。当用5 mol %的游离PLP辅因子替代酶催化剂进行反应时却没有获得产物，这凸显了PLP辅因子和蛋白质骨架之间的协同作用。值得一提的是，该生物催化剂能够选择性地将外消旋 (D/L)-丝氨酸[(rac)-2a]转化为单一的异构体L-3a并且具有相同的产率和e.r.值。此外，将水性缓冲液的pH值从6.0增加至8.0后，反应的对映选择性会逐步降低，并且在pH 8.0的条件下获得了外消旋产物3a（49:51 e.r.）。其次，作者还测试了一个小的PLP酶变体库，发现L-PfPLPβ的单突变体E104G（即D-PfPLPβ）逆转了对映选择性（图2B），以79%的产率和6:94 e.r.值生成D-高苯丙氨酸D-3a。类似地，D-PfPLPβ也能选择性地将过量的(D/L)-丝氨酸[(rac)-2a]以相同的产率和对映选择性转化为D-3a。有趣的是，D-PfPLPβ的生物催化对培养基的pH值不敏感，并且在较高pH值下对映选择性有所增加。

图3. 底物拓展。

在最优条件下，作者对该反应的底物范围进行了探索（图3），结果显示L-PfPLPβ和D-PfPLPβ均可有效促进多种三氟硼酸盐底物的转化，包括：芳环上对位（3b）、间位（3c）和邻位（3d）甲基、间位（3e）和对位（3j）甲氧基、间位氟原子（3f）、氯原子（3g）、酯基（3h）、氰基（3i）取代的苄基三氟硼酸盐、大位阻双环底物（3k、3l）以及烷基三氟硼酸盐底物（3m-3o），尽管烷基三氟硼酸盐底物产率低。此外，D-PfPLPβ催化3m进行反应时生成的主要对映体是L-3m。值得一提的是，L-PfPLPβ催化反应时para-(L-3b) 要比meta-(L-3c) 和ortho-(L-3d) 取代的底物具有更高的对映选择性；而使用D-PfPLPβ催化反应时，三种底物的对映选择性相当（D-3b至D-3d）。

图4. 双催化构建相邻立体中心。

该双催化策略能以优异的非对映选择性和对映选择性构建颇具挑战性的连续立体中心化合物，无需进一步的定向进化。如图4A所示，L-PfPLPβ能够有效催化苏氨酸（2b）和多种苄基三氟硼酸盐的反应，并以优异的产率和立体选择性获得具有相邻α和β立体中心的异亮氨酸衍生物（4a-4e）。此外，外消旋仲烷基自由基前体[(rac)-1p]也能兼容该反应，以优异的产率、非对映选择性和对映选择生成具有三个相邻立体中心的产物5a（图4B）。值得一提的是，回收的底物1p在不同转化率下的e.r.值为50:50，这表明该过程不涉及(rac)-1p的动力学拆分，进而证实了该过程的对映汇聚式转化。最后，作者还通过N-酰化产物6a、6b和6c的X-射线单晶衍射分析确定了C-C键偶联产物3a、4a和5a的相对立体化学和绝对立体化学（图4C）。为了进一步探究反应机理，进行了自由基捕获实验，在标准条件下以14%的产率获得TEMPO捕获自由基产物，同时模型反应（1a+2a→L-3a）的GC-MS分析获得了苄基自由基衍生的副产物（如：二苄基（~1%）和PhCHO（~5%）），这些结果证实了反应过程中苄基自由基的生成。

图5. 计算化学研究。

还进行了密度泛函理论（DFT）计算（图5A），结果表明内部醛亚胺与外部醛亚胺7之间的转化需要低活化能垒。此外，Marcus理论计算表明11与还原型光催化剂[RhB]•−之间的ET（可能是通过远程ET）在动力学和热力学上都是可行的，随后的PT步骤（TS-4）能垒相对较低（16.0 kcal/mol）。如图5B、5C所示，过渡态计算表明蛋白质骨架在控制苄基自由基9与氨基丙烯酸酯10加成的区域选择性方面具有关键作用，这是因为自由基加成到β位（C1）要比C2位的能垒低（ΔΔH‡=3.2 kcal/mol）。

综上，利用光氧化还原催化和吡哆醛5'-磷酸（PLP）生物催化的协同催化策略，开发了一种吡哆醛自由基生物催化方法来制备有价值的非天然氨基酸，无需保护基团即可构建具有两个或者三个立体中心的非天然氨基酸。值得一提的是，通过酶工程还可以获得L-氨基酸和D-氨基酸。毫无疑问，这种协同催化策略为发现前所未知的反应和研究不对称催化自由基中间体提供了一种新的思路。

https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.adg2420

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