酶响应型肽水凝胶及应用研究进展

引用：白靖琨, 盛成乐, 张宇, 王景新 . 酶响应型肽水凝胶及应用研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展,2016, 43(11): 1048-1060.

摘要: 酶响应型肽水凝胶可用于缓控释药物的释放，并具有抗菌、抗肿瘤等作用，是目前材料领域新兴的的研究热点之一.本文总结了近年来国内外开发的酶响应型肽水凝胶材料，重点介绍了包括谷氨酰胺转氨酶、激酶、磷酸酶、赖氨酸氧化酶(血浆氨氧化酶)、蛋白酶、酯酶、茁内酰胺酶、基质金属蛋白酶等酶响应型肽水凝胶，以及在酶的催化作用下，水凝胶的形成、破坏或动态转换，同时总结了它们的响应机理.此外，介绍了酶响应型肽水凝胶的应用.酶响应型肽水凝胶具有广阔的发展前景，是未来智能响应材料的发展方向之一.

近几十年来，对环境可感知且可响应，并具有特定功能的智能响应材料已经出现，可以满足更多的材料性能需求，促进诸如医疗卫生[1-2]、电子技术[3]、能量存储[4]等技术的发展.这种能够改变功能材料形态或功能的响应因素有很多，如pH[5-7]、温度[8-9]、光[10-11]、电化学因素[12-13]等等，近年来，酶催化作用下的肽自组装材料得到关注和研究[14-15].在生物体中，所有生命活动最终受酶控制，因此在相应酶刺激下形态或功能改变的生物材料具有广阔的应用前景.受此启发，酶被越来越多地用于触发改变仿生材料的性能[16-17].

在生命活动中，酶的底物主要由氨基酸组成.氨基酸通过酰胺键形成的肽分子，由于其生物相容性好、可生物降解，并具有一定的生物活性，与传统自组装分子相比有着不可比拟的优点，在分子自组装体系中占有重要地位，在生命健康等领域具有良好的应用前景.酶响应型水凝胶即是在酶的催化下，肽及衍生物等底物分子发生特定的化学反应，化学结构发生改变，肽分子等聚集成纳米尺寸的超分子单元，单元间的作用力促使其在空间上规则排列，如形成纳米纤维等，再进一步表现为宏观上的相变，如水凝胶结构的形成或溶胶-凝胶结构的转变等.

虽然国际上已经对酶响应型肽水凝胶进行了大量的研究[18]，但目前国内的相关报道较少，所以我们结合近年来文献报道情况，对酶响应型肽水凝胶的酶因素，酶响应型肽水凝胶的形成、破坏、动态转换等相变，以及酶响应型肽水凝胶的抗菌、抗肿瘤等应用分别进行介绍.

1 酶响应型肽水凝胶

酶通过催化作用能够诱导响应材料在原位形成水凝胶，并且反应条件温和.酶催化方法相较于其他传统方法，如物理交联法等，能够避免制备的水凝胶物理性强度低、稳定性差等问题.同时，酶催化下自组装形成的水凝胶，有其自身的优越性：如酶催化有专一的化学、区域选择性，催化反应条件温和等.基于以上优点，酶响应型水凝胶越来越多地得到人们的关注[1, 15].

就材料而言，很多酶响应型水凝胶的组成材料主要是肽及其衍生物；就酶响应型水凝胶的酶因素而言，生物体内催化肽响应的酶种类繁多，但目前已被用于诱导材料形成水凝胶或水凝胶破坏的酶种类较少，目前已用于研究的酶如谷氨酰胺转氨酶、激酶、磷酸酶、赖氨酸氧化酶、蛋白酶、酯酶、β内酰胺酶、基质金属蛋白酶等.

1.1 谷氨酰胺转氨酶响应型水凝胶

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TG酶)含有巯基，可催化肽键的形成，并进一步修饰蛋白质，如多肽的共价连接或谷氨酰胺残基的脱氨作用等[19-20].谷氨酰胺转氨酶可温和替代化学交联法，它能催化蛋白质的游离氨基与γ-碳酰胺之间发生共价交联，形成分子间或分子内聚合物，同时将氨基脱去(图 1a)[21]，有助于减少肽分子携带的正电荷，故而可以在不加入辅助因子的情况下，组装成稳定的高分子网络结构，形成自支撑水凝胶.

Fig. 1 Enzymatic reaction mechanism of different enzymes in the enzyme responsive peptide hydrogel

图 1 酶响应型肽水凝胶中不同酶的酶促反应机理 (a)谷氨酰胺转氨酶. (b)激酶与磷酸酶. (c)赖氨酸氧化酶/血浆氨氧化酶. (d)枯草杆菌蛋白酶与嗜热菌蛋白酶. (e)酯酶. (f)茁内酰胺酶. (g)基质金属蛋白酶2

Davis等[22]设计一种富含赖氨酸的肽聚合物，及一种富含谷氨酰胺的肽聚合物，在加入TG酶后，可原位快速形成水凝胶，成胶1 h后，用流变仪进行频率扫描，储能模量稳定在10 kPa左右，扫描电镜显示成胶后自组装形貌为网络结构，作为组织材料用于哺乳动物细胞培养，其生物毒性低.Collier等[23]设计肽分子Q11(Ac-QQKFQFQFEQQ-Am)，通过圆二色谱和红外光谱检测发现，形成β折叠结构，在Q11溶液中加入盐离子，或改变pH值，放置一定时间后，透射电镜负染和冷冻电镜观察发现形成高度交联的网状纤维结构.在溶液中加入赖氨酸替代物MDC与TG酶，通过MALDI-TOF质谱(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)和HPLC (高效液相色谱)证明，Q11与赖氨酸替代物MDC在TG酶作用下生成共价交联产物，有多达5个谷氨酰胺可与MDC交联，此方法可用于肽的装配后修饰.Schmid等[24]报道，TG酶会诱导不溶性病变的产生，研究淀粉样蛋白Aβ加入TG酶后的改变，通过质谱数据中0.984 Da的减少，发现第15位谷氨酰胺氨基的丢失，证明TG酶诱导分子内交联导致单体结构改变，谷氨酰胺转化为谷氨酸.通过MALDI-TOF质谱分析证明，在谷氨酰胺转氨酶作用下生成分子间共价交联的Aβ1-40二聚物，透射电镜发现加入TG酶1 h后有聚集体出现.作者所在课题组设计两亲性短肽Ac-I3QGK-NH2，在水溶液中自组装形成纳米带，加入谷氨酰胺转氨酶后，形成具有一定机械强度的水凝胶，储能模量在5 kPa以上，破坏后可快速恢复.透射电子显微镜和原子力显微镜观测发现此时形成纳米纤维，通过HPLC和MALDI-TOF质谱分析发现，短肽在酶的催化作用下共价交联形成二聚体；动物出血时，凝血因子ⅩⅢ在凝血酶作用下生成有活性的TGase (ⅩⅢa因子).所以相较于其他止血方法，短肽Ac-I3QGK-NH2溶液可以更快速有效地止血、凝血和促进血小板黏附，同时该短肽对正常哺乳动物细胞毒性低，不会引起非特异性免疫反应，在临床止血上具有一定的应用潜力[25].

1.2 激酶/磷酸酶响应型水凝胶

激酶(kinase)是可以从高能供体分子(如ATP等)转移磷酸基团到底物上的一类酶，磷酸酶(phosphatase)可催化除去底物上的磷酸基，增强底物的疏水性(图 1b)[26-28]，而在水环境中，疏水性底物可通过非共价相互作用(例如π-π相互作用、氢键、电荷间作用力等)自组装成三维网络结构并形成水凝胶[29].

2004年，杨志谋等[29]第一个报道磷酸酶响应下超分子水凝胶的形成，研究人员用碱性磷酸酶作用于两亲性底物磷酸化酪氨酸(Fmoc-pY，Fmoc=芴甲氧碳基)，使其去磷酸化形成Fmoc-Y，在π-π堆积作用下形成自支撑水凝胶，储能模量在1 kPa左右，圆二色谱显示α螺旋结构的形成，扫描电镜与透射电镜观察发现形成网状纤维结构.自这一开创性的工作开始，其他的一些磷酸酶催化的肽水凝胶陆续被设计，包括Nap-FFGEpY (Nap=萘基)[27]，Nap-FFpY[30]，Nap-GFFpY-OMe[31]，Ac-YYYpY-OMe (Ac=酰基)[32]，Fmoc-FpY[33].杨志谋课题组研究浓度为1.0%(质量百分比)的Fmoc-pY-OMe肽溶液，在分别加入终浓度16 U/ml和4 U/ml磷酸酶的作用下，去磷酸化生成Fmoc-Y-OMe，10 min内快速形成水凝胶.透射电镜和扫描电镜观察发现，自组装形貌为宽纤维和薄膜，高效液相色谱结果表明，产物转化率分别为64.3%和62.8%，pH值从0~9范围内，水凝胶稳定；论文研究了凝胶的形成机理，认为芴基反平行排列于纳米纤维的中心，有助于自组装形貌的形成[28].徐兵课题组研究1a (Fmoc-pYGGDADA)与万古霉素结合后，加入碱性磷酸酶，1a去磷酸化生成1b (Fmoc-YGGDADA)，自组装形成聚集体，通过等温滴定量热法(ITC)测定1a，1b与万古霉素结合的解离常数(Kd)，1a在加入碱性磷酸酶后，光散射强度随时间增加逐渐增大，在2.5 h左右达到峰值，然后逐渐降低，万古霉素、1a与1b对人宫颈癌HeLa细胞的半抑制浓度(IC50)都大于500 μmol/L，同时加入相同摩尔比的1a与万古霉素，半抑制浓度低于300 μmol/L，两者共组装提高了抗肿瘤活性[34].

杨志谋课题组研究在磷酸酶作用下，L-型短肽Nap-GFFpY-OMe或D-型短肽Nap-GDFDFDpY-OMe与卵清蛋白共组装形成的水凝胶可以作为优良的疫苗佐剂，与临床上使用的明矾佐剂相比，该肽水凝胶可提高抗原吸收，诱导树突状细胞成熟，促进生发中心的形成，L-型与D-型肽水凝胶可以分别增加约1.3倍和3.8倍的免疫球蛋白G (IgG)的产生，同时具有良好的生物相容性[35].此外，Ulijn课题组进一步研究磷酸酶催化下的分子自组装与胶束-纤维转换之间的关系[36].

通过激酶的磷酸化和磷酸酶的去磷酸化可以改变底物的两亲性，利用这对酶催化各自的互补逆向反应，可以获得动态可逆的超分子水凝胶.徐兵课题组设计两亲性肽(Nap-FFGEY)，在该酶体系下，诱导凝胶形成溶胶(激酶)和溶胶形成凝胶(磷酸酶)，ATP决定了自组装状态[27].Webber等[37]设计了两亲肽PA1(KRRASVAGK[C12]-NH2)，1 mmol/L肽PA1在Tris-HCl缓冲液中可自组装形成水凝胶，冷冻电镜观察自组装形貌为纳米纤维结构，在蛋白激酶A和ATP的作用下丝氨酸磷酸化，两亲肽的亲水性增强，水凝胶破坏，转化为溶胶，纳米结构消失，圆二色谱显示二级结构从β折叠转变为无规卷曲.

1.3 赖氨酸氧化酶响应型水凝胶

赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase，LO)是细胞外基质形成和修复的关键因素，该酶可催化赖氨酸的伯氨基氧化成活泼的醛基，并进一步交联形成席夫碱(图 1c)[38-39].赖氨酸氧化酶可用于形成和修复细胞外基质[40].血浆氨氧化酶(plasma amine oxidase，PAO)的功能也是对伯氨基进行氧化，并且已经商业化[41].这两种酶可以随时间延长提高生物材料或者组织的强度[42].

利用血浆氨氧化酶，Hartgerink课题组[41]设计多域肽K2(SL)6K2，通过血浆氨氧化酶氧化赖氨酸侧链上的ε-氨基形成醛，并最终形成希夫碱，使肽分子携带正电荷减少，促使肽溶液形成水凝胶，同时形成大量的纳米纤维结构.由于血浆氨氧化酶具有持续活性，该酶形成的水凝胶强度随时间增加，加入血浆氨氧化酶的高效抑制剂后，则无法形成水凝胶.白靖琨等[43]设计两亲性短肽Ac-A9K2-NH2，在水溶液中自组装形貌为纳米棒，在加入血浆氨氧化酶后自组装形成纳米纤维，同时形成自支撑水凝胶，机械强度在300 Pa以上，研究了酶催化水凝胶形成的机理：MALDI-TOF质谱检测发现，赖氨酸侧链的ε-氨基在酶的催化氧化下，发生分子内或分子间共价交联形成希夫碱，希夫碱进一步吸收羟醛缩合释放的H，最终形成更为稳定的碳氮化合物，肽分子携带的正电荷减少，分子间斥力降低，有助于水凝胶的形成，该水凝胶具有良好的破坏-恢复性能，以及良好的抑菌作用.

1.4 蛋白酶响应型水凝胶

蛋白酶(protease)是水解蛋白肽链的一类酶，主要作用是水解氨基酸链的肽键[44-45].目前研究较多的是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)[46]和嗜热菌蛋白酶(thermolysin)(图 1d)[47].Ulijn等[48]采用枯草杆菌蛋白酶使Fmoc-L2-OMe的酯键裂解形成Fmoc-L2，增加前体溶解度，此时形成水凝胶，自组装形貌为纳米管结构，红外光谱表明二级结构为β折叠结构，高效液相色谱检测到了新产物的生成.Hirst等[46]进一步报道枯草杆菌蛋白酶触发水凝胶的形成，考察了Fmoc-R1R2-OMe (R1/R2=Y，F，L，V)在枯草杆菌蛋白酶作用下生成Fmoc-R1R2的变化，甲氧基通过枯草杆菌蛋白酶的水解作用除去，肽分子自组装形成纳米纤维，同时形成水凝胶.

与枯草杆菌蛋白酶催化酯键的裂解不同，嗜热菌蛋白酶主要催化两肽化学键的形成，可被用来连接两条不同的肽(图 1d)[47].对于侧链上含疏水基团、芳香基团的氨基酸，嗜热菌蛋白酶的催化效果尤其好.Ulijn等通过耦合非凝胶二肽(FF)到一个单一的Fmoc保护氨基酸(Fmoc-F)，通过嗜热菌蛋白酶的反水解作用，产生自组装的Fmoc三肽(Fmoc-F3)，形成自支撑水凝胶，并用于细胞培养，扫描电镜显示自组装形貌为网状纤维结构，使用高效液相色谱考察了产物的转化率[47].Hughes等[49]进一步利用此方法制备二维纳米结构，由Fmoc-S和F-OMe通过嗜热菌蛋白酶反水解形成Fmoc-SF-OMe，同时形成水凝胶，电镜和冷冻电镜观察自组装形貌为宽片状结构.Hughes等[50]继续研究了利用嗜热菌蛋白酶形成Fmoc-SL-OMe、Fmoc-TF-OMe、Fmoc-TL-OMe，使用红外光谱对产物进行了考察，透射电镜观察Fmoc-SL-OMe为带状结构，Fmoc-TF-OMe为扭曲的长纤维，TL为扭曲的短纤维，流变学实验表明Fmoc-TF-OMe的机械强度优于FmocTL-OMe和Fmoc-SL-OMe，储能模量可达到10 kPa.

1.5 酯酶响应型水凝胶

酯酶(esterase)一般指水解脂肪酸酯的脂肪酶，但部分酯酶也可以催化氨基酸等的酯水解反应[51].Palocci等采用酯酶展开反水解诱导从Fmoc-F和F2水凝胶化为Fmoc-F3，通过流变学实验研究了水凝胶的黏弹性，机械强度在10 Pa左右，SEM和AFM图像证实肽自组装产生超分子聚集体，驱动力为Fmoc基团的π-π堆积作用[52].徐兵课题组设计分子1a (C10H7CH2C (O)-phe-phe-NHCH2CH2OC (O) CH2CH2C (O) OH)，在酯酶作用下酯键断裂，生成2a (C10H7CH2C (O)-phe-phe-NHCH2CH2OH)，在浓度超过0.08%(质量百分比)时形成水凝胶，自组装形貌为纳米纤维(图 1e)，1a分子可以进入HeLa细胞内部，HeLa细胞释放的酯酶可诱导生成2a，在胞内形成水凝胶，导致HeLa细胞的死亡，同时MTT实验证明该水凝胶对成纤维细胞NIH3T3毒性低[53].刘育课题组设计SC4A与肉豆蔻酰胆碱组成的囊泡，加入胆碱酯酶后，透射电镜和扫描电镜观测到囊泡破坏，包裹模型药物实验表明该囊泡可用于药物的控制释放与传递[54].徐兵课题组配制0.4%(质量百分比)浓度的D-1(Nap-DFDFDG-CO (O)-(CH2)2-C (O)-N (H)-(CH2)2-SO3H)肽溶液，在羧酸酯酶的作用下，酯键断裂生成D-2(Nap-DFDFDG-COOH)，自组装形成纳米纤维结构，静态光散射强度明显提高，同时形成自支撑水凝胶.在D-1与顺铂共同存在的情况下，人卵巢癌细胞SKOV3与A2780细胞死亡率明显高于只加入顺铂时，提高了顺铂的抗肿瘤活性；使用荧光染料鬼笔环肽对SKOV3细胞染色发现，在加入D-1后肌动蛋白丝明显减少，说明酶诱导肽自组装形成的纳米纤维表现出一定的细胞毒性，最终提高对耐药性卵巢癌细胞的抗肿瘤效果[55].

1.6 β内酰胺酶响应型水凝胶

β内酰胺酶(β-lactamase)诱导催化抗生素分子中的四元环结构，即β内酰胺环的断裂[56](图 1f).开环后，抗生素分子的抗细菌特性失去，从而使细菌产生耐药性.通过内酰胺酶的作用，内酰胺环被打开，凝胶基元被释放并自组装，进一步形成纳米纤维和水凝胶.β内酰胺酶在细胞内引发自组装进而形成水凝胶，所以可以应用于内酰胺酶的检测，或者杀死特定的细菌，因为此类超分子水凝胶可以在细胞内形成[57-58].杨志谋等[57]研究自组装分子Fmoc-FF通过β内酰胺键耦合到一个亲水基团上，无明显自组装形貌，在β内酰胺酶的作用下释放肽分子，1 h后产物产率为49.0%，形成不透明水凝胶，自组装体为纳米纤维结构，加入β内酰胺酶的抑制剂，则无法诱导形成水凝胶，加入超声破碎后的大肠杆菌，能够诱导产生水凝胶，高效液相色谱结果显示产物产率可高达99.7%，提供了检测β内酰胺酶的一种新方法.

1.7 基质金属蛋白酶响应型水凝胶

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)可降解特定的氨基酸序列，因其需要金属离子如Ca2+、Zn2+等作为辅助因子而得名[59-62].MMP家族各成员具有一定的底物特异性.Hartgerink等设计了一个酶MMP-2敏感的自组装两亲性肽[63]，MMP-2可特异性降解肽序列GTAGLIGQ的甘氨酸(G)与亮氨酸(L)之间的连接位点，该肽暴露于MMP-2，水凝胶并没有被直接破坏，而是缓慢坍塌，表现为胶束的增加与纤维的缩短.Langer等设计了MMP-2敏感序列(RADA)3PVGLIG (RADA)3，可形成超分子水凝胶，形貌为纳米纤维结构，二级结构为β折叠，加酶降解后，质谱分析发现产物(RADA)3PVG与LIG (RADA)3的生成，形成的水凝胶在加酶后机械强度没有明显改变，但是表面硬度大幅降低[64].徐兵课题组[65]设计短肽FFFFCGLDD，在pH 6.0时形成水凝胶，升高pH至7.4时水凝胶破坏，GLDD是MMP-9的作用位点，在加入MMP-9后，肽分子酶促降解脱去LDD，导致较小的自组装肽基元FFFFCG释放，并再次形成水凝胶，高效液相色谱检测生成31.8%的FFFFCG，同时有15.4%的FFFF生成，此时储能模量稳定在100 Pa以上，透射电镜显示自组装形貌为纳米纤维(图 1g).Ulijn课题组研究两亲肽GFFLGLDD在浓度为5 mmol/L时自组装形成球形胶束，在加入终浓度为50μg/L的MMP-9后，裂解主要产生肽片段GFFLGL，自组装形成纳米纤维结构，同时有少量肽片段GFF与LGLD、GF与FLGLDD生成，但并未裂解产生期望中的短肽GFFLG，此结果说明MMP-9还可降解F与L、F与F之间的肽键，最终在基质金属蛋白酶MMP-9的作用下，完成了球形胶束到纳米纤维的转换，并释放抗肿瘤药物阿霉素[66].

2 酶响应型肽水凝胶的相变

在酶的催化作用下，肽及衍生物等组装基元会发生化学结构的改变，引起纳米球、纳米纤维、纳米管等自组装形貌的改变，或从无自组装形貌到形成特定的自组装体.在这个过程中，自组装形貌的部分改变会引发水凝胶的相变行为，如水凝胶的形成或破坏，以及溶胶-凝胶结构的动态转换.

2.1 酶响应型肽水凝胶的形成

催化肽及衍生物、合成高聚物等材料响应的酶，多用于水凝胶形成，但催化机理各不相同：谷氨酰胺转氨酶催化游离氨基与γ-碳酰胺之间形成新的酰胺键，可用于共价化合物的生成[25, 67]；磷酸酶催化底物去磷酸化，使底物疏水性增强[27, 68]；赖氨酸氧化酶催化伯氨基氧化成醛基，进一步反应形成希夫碱，可降低赖氨酸侧链所带电荷[41, 43]；枯草杆菌蛋白酶裂解酯键，增加前体的溶解度[46, 69]；基质金属蛋白酶通过降解特定氨基酸序列[70]，释放自组装基元，引起水凝胶的形成[63].

如Tanaka等[71]设计酶响应型抗肿瘤水凝胶前体因子ER-C16 (十六烷酰-GGGHGPLGLARK-CONH2)，该序列含有基质金属蛋白酶MMP-7降解序列PLGL，自身无法形成自组装体，可以在加入MMP-7后，降解产生凝胶因子G-C16(十六烷酰-GGGHGPLG)与肽片段LARK-CONH2，透射电镜结果显示G-C16自组装形成纳米纤维结构，同时形成水凝胶，活/死细胞染色实验表明，G-C16可以进入HeLa细胞内部，并形成纳米纤维结构，从而特异性杀死HeLa癌细胞，同时对正常细胞皮肤血管内皮细胞(MvE细胞)毒性低.

2.2 酶响应型肽水凝胶的破坏

激酶催化底物磷酸化[72]，亲水性增强，水凝胶破坏[37]，枯草杆菌蛋白酶裂解酯键，也可降解水凝胶[15].酯酶催化酯键断裂[53]，也可用于破坏囊泡[54].基质金属蛋白酶降解特定氨基酸序列，使凝胶因子破坏，也可用于水凝胶的坍塌[63].

如Khelfallah等[73]使用短肽GGL连接聚氧乙烷PEO形成超分子凝胶，加入谷草杆菌蛋白酶催化肽分子的降解，最终引起水凝胶的破坏，同时通过重量测定分析了水凝胶的降解率.Moore课题组[15]研究短肽CYKC连接的高聚物，自组装形成水凝胶，在加入枯草杆菌蛋白酶后，酪氨酸与赖氨酸之间的肽键断裂，三维交联网络结构转化为水溶性聚合物，水凝胶破坏，此技术可用于生物传感等领域.

2.3 酶响应型肽水凝胶的动态转换

磷酸酶/激酶系统可催化肽、聚合物等的去磷酸化和磷酸化作用，引起凝胶因子亲疏水性的改变[26-27, 74-75]，枯草杆菌蛋白酶/嗜热菌蛋白酶系统可用于酶响应材料的水解和反水解，引起分子结构的改变[48, 76]，此系统已成功用于溶胶-凝胶之间的状态转换.杨志谋课题组使用磷酸酶/酪氨酸酶诱导水凝胶的动态转换，该课题组研究肽序列Ac-YYYpY-OMe，在加入磷酸酶后去磷酸化生成Ac-YYYY-OMe，形成水凝胶，流变实验显示储能模量为900 Pa左右，自组装形貌为纳米纤维结构，再加入酪氨酸酶，酪氨酸氧化生成醌类化合物，水凝胶破坏形成褐色溶液(图 2)，MTT实验表明，水凝胶对成纤维细胞NIH 3T3毒性低[32].

Fig. 2 Dynamic phase transition of enzyme responsive peptide hydrogel

图 2 酶响应型肽水凝胶的动态相变 (a)酪氨酸酶和磷酸酶催化溶胶凝胶相转变的示意图. (b)光学图像. A: Ac-YYYpY-OMe的溶胶，B:磷酸酶处理后形成凝胶，C:酪氨酸酶处理后再次形成溶胶.

3 酶响应型肽水凝胶的应用

目前关于水凝胶的研究多集中在合成高分子水凝胶上[8]，高分子水凝胶具有一定的缺点，如稳定性好、不易降解、生物可控降解性差.此外，部分自组装水凝胶因子中含有PAs[77]、Nap-FFG[78]、Fmoc-FF[79]等脂肪链、萘和Fmoc稠环芳香烃等，在临床应用时可能引起机体的非特异性免疫反应.与之相比，肽水凝胶毒性低、生物相容性好、易降解.基于肽纳米材料作为自组装基元形成的水凝胶，可执行各种功能，如模仿细胞的三维环境[58]，或在生物医学应用中作为可注射支架[27].

酶广泛存在生物机体内，酶促反应是维持生命活动的重要过程.例如在ECM形成和重构中酶发挥着关键作用，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)通过降解基质成分而实现ECM重构和组织再生[80]；谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TG)通过共价交联纤维蛋白可以加速凝血，促进伤口的愈合[81].更为重要的是，酶促反应具有专一性强、条件温和、转化效率高等特点，而且酶促肽水凝胶降解时只产生氨基酸，对机体不会产生不良影响，导入机体后，一般不会引起免疫反应和组织炎症.通常当材料暴露在酶促反应附近，其属性会发生改变，利用此特点，酶响应材料可用于分析检测[82-85]、药物传递[86-88]等，目前，科研人员多将其用于缓控释药物、抗菌、抗肿瘤等方面.

3.1 药物释放

不同于pH、温度等智能响应材料，在刺激因素消失后，材料响应的功能消失，酶响应材料在酶消失后，响应仍存在.此外，生物体内存在大量的酶，所以，水凝胶在酶响应下降解，有望用于药物在体内的缓慢释放或控制释放.如将一些特异性酶切位点引入到作为凝胶基元的肽序列中，在该酶催化下可促使肽段断裂，从而导致凝胶坍塌[63]，可携带药物治疗释放特异性酶的病变细胞.杨志谋课题组设计Ac-YYYY-OMe肽序列形成的水凝胶，包埋刚果红染料后，通过加入不同浓度的酪氨酸酶，紫外测定显示可有效控制刚果红的释放量[32].Stupp课题组设计两亲肽形成的水凝胶，在加入激酶后形成溶胶，可用于释放抗癌药物阿霉素，杀死乳腺癌细胞，但对小鼠成纤维细胞毒性低[37].

Ulijn课题组研究两亲肽GFFLGLDD在加入乳腺癌细胞株MDA-MB-231-luc-D3H2LN后，细胞释放基质金属蛋白酶MMP-9，催化两亲肽断裂释放自组装基元GFFLGL，自组装形貌从球形胶束转换为纤维，释放抗肿瘤药物阿霉素.通过小鼠体内实验研究发现，同时注射短肽GFFLGLDD与阿霉素，与单独注射阿霉素相比，肿瘤体积减小更加明显，抑制细胞生长效果更好.两亲肽在肿瘤部位的特异性裂解，引起化疗药物的局部释放，从而有效提高抗肿瘤效果，但与下述研究不同，该研究实现抗肿瘤效果的本质是通过肽材料的药物释放完成的[66].李峻柏课题组也设计含肽分子的自组装体作为药物载体包埋阿霉素，在胰酶触发下释放药物，实现低浓度下杀死人宫颈癌HeLa细胞[89].

3.2 抗肿瘤作用

徐兵课题组使用万古霉素(VAN)通过配体受体间的相互作用，催化D-Ala-D-Ala衍生物Fmoc-KGG (D) A (D) A形成聚集体.该聚集体可引起HeLa细胞的程序性死亡.而如果把肽分子进行修改，去掉Fmoc基团，或者将D-Ala换成L-Ala，则对HeLa细胞的毒性消失[90]，此工作为理解小分子的分子聚集毒性提供了帮助.Ulijn报道Fmoc-葡萄糖胺-6-磷酸去磷酸化形成纳米纤维，同时伴随凝胶的形成，可以抑制释放碱性磷酸酶的人骨肉瘤细胞SaOs-2的生长，而小鼠成软骨细胞ATDC5不产生碱性磷酸酶，不能诱导凝胶的生成，可正常生长[91].徐兵课题组进一步研究两亲肽Nap-FFpY-HNMe (1p)、Nap-FFpY-HNNH2(2p)、Nap-FFpY-OMe (3p)、Nap-FFpY-OH (4p)在加入碱性磷酸酶后，肽分子C端去磷酸化分别生成1、2、3、4，自组装能力增强，形成纳米纤维结构，静态光散射强度明显提高，在0.5%肽浓度(质量百分比)加入0.05 U/ml碱性磷酸酶后，10 min内快速形成水凝胶，储能模量1p＞2p＞3p＞4p，其中1p加入碱性磷酸酶后储能模量接近100 Pa，能够有效抑制人骨肉瘤细胞SaOs-2的生长，1p、2p、3p与4p对SaOs-2细胞的IC90(90%抑制浓度)依次为36、97、37与470 μmol/L，同时对人骨髓基质细胞HS-5毒性低，在1p、2p、3p环境中加入碱性磷酸酶的抑制剂左旋咪唑，细胞存活率有所提高，在1p、2p、3p环境中加入凋亡抑制剂(zVAD-fmk)，细胞存活率变化不大，而加入坏死抑制剂(Nec-1)，细胞存活率明显提高，说明加入两亲肽导致Saos-2细胞的死亡，较多的依赖于细胞坏死机制而非细胞凋亡机制[92].该课题组继续研究在酶诱导下肽分子的胞内自组装，以及其在癌细胞治疗中的应用，同时对该抗肿瘤机制进行研究[93-94].此外，Maruyama等[71]、杨志谋课题组[95]等也报道了通过小分子自组装形成纳米纤维抑制肿瘤细胞的生长.

3.3 抗菌作用

Schneider课题组以发卡肽MAX1(VKVKV-KVKVDPPTKVKVKVKV)[72]为基础，设计了一系列抗菌肽，如MARG1(VKVKVRVKVDPPTKVKVRV-KV)[96].此外，研究富含精氨酸的肽序列PEP6R (VKVRVRVRVDPPTRVRVRVKV)，在300 mmol/L NaCl存在的条件下可自组装形成水凝胶，可有效杀灭在水凝胶上方加入的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，以及大肠杆菌、耐药铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌.激光共聚焦扫描显微镜进行Z轴扫描发现，水凝胶上方细菌呈碘化丙啶(PI)染色后的红色，显示为死菌，原子力显微镜三维正交投影图像显示此时大肠杆菌表面细胞膜破损，在水凝胶上方培养小鼠间充质干细胞C3H10T1/2，活/死细胞染色显示大部分细胞存活，表现出优良的细胞相容性[97].作者等设计两亲性短肽Ac-A9K2-NH2在血浆氨氧化酶作用下形成水凝胶，通过增加细胞膜的通透性，有效抑制细菌的生长，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌、大肠杆菌和绿脓杆菌等革兰氏阴性菌具有高效抑菌效果，24 h后的抑菌率在70%以上，同时对哺乳动物细胞显示出极低的细胞毒性.在水凝胶上进行细菌-细胞共培养后，使用荧光染料碘化丙啶(红色)和SYTO 9(绿色)对样品双染后发现，大部分细胞呈表示存活的绿色，大部分细菌呈表示死亡的红色(图 3)，对照组结果相反.在共培养条件下，肽水凝胶表现出优异的选择性，有利于哺乳动物细胞MIH 3T3的黏附和增殖，同时杀死致病菌，作为组织培养材料可以有效避免细菌污染[43].

Fig. 3 The aqueous solution of Ac-A9K2-NH2 formed hydrogel under the action of Plasma Ammonia Oxidase, and laser scanning confocal microscopy images of NIH 3T3 cells after the introduction of bacteria

图 3 Ac-A9K2-NH2溶液在血浆氨氧化酶的作用下形成水凝胶，以及在水凝胶表面培养细菌与NIH 3T3细胞后的共聚焦显微镜图片

此外，杨志谋课题组设计磷酸酶响应型短肽Nap-GDFDFDpY-OMe水凝胶作为潜在的疫苗佐剂[35]，作者所在课题组设计谷氨酰胺转氨酶响应型短肽Ac-I3QGK-NH2水凝胶具有快速止血和凝血性能[25].酶催化诱导水凝胶的形成、水凝胶到溶胶的转化、以及荧光强度的变化，同样可以用于酶的检测.McNeill[98]，张先正[99-100]，徐兵[101]、杨志谋[102]等对此进行了研究.McNeil课题组通过基质金属蛋白酶MMP-9诱导下水凝胶的形成检测蛋白酶活性[103]; 杨志谋课题组通过酶诱导下肽纳米球的解组装用于酪氨酸酶的检测[104]，并综述了可视的凝胶-溶胶转变应用于酶的检测[105]；徐兵等进一步研究磷酸酶催化形成的水凝胶诱导肿瘤细胞的凋亡[106-107]；Ulijn等[108-109]则对酶催化肽序列反应过程中的酶催化动力学进行了探讨.

4 总结与展望

作为一类智能响应材料，酶响应型水凝胶的构筑材料多为肽及衍生物，用于刺激水凝胶形成或破坏的酶在生命体内大量存在，在医学健康领域有广阔的应用前景.在酶响应型水凝胶的相变过程中，酶的催化刺激是途径，其机理是改变材料的疏水性或溶解度，降低或增加材料携带电荷，释放或破坏自组装基元等，最终在酶的刺激响应下，肽及衍生物等材料实现水凝胶的形成、破坏或动态转换等相变行为.酶响应型水凝胶可被用于细胞的三维培养，作为可注射骨架等.部分肽水凝胶抗菌效果显著，不会产生耐药性，且对肿瘤细胞有毒害作用，同时对正常细胞毒性低，可用于抗菌、抗肿瘤，还可用于药物释放等，发展潜力巨大.

酶响应型水凝胶应用前景广泛，已经得到越来越多科研人员的关注，但该领域研究时间较短，需要不断开发用于酶响应型水凝胶的新型材料，重点开发功能性肽材料.对于肽材料的设计，就分子结构而言，可以考虑以下方面：亲疏水氨基酸残基的种类、数目、排列顺序、引入其他功能性或响应性基团、加入保护基等；共组装体系的构建，可将肽与肽、肽与表面活性剂、肽与染料分子、肽与其他酶响应底物等结合.就酶而言，除了目前已用于材料响应的酶，可进一步开发用于生物体内、易引起材料功能响应、活性高的酶；除了研究较多的以肽为底物的酶，还可以研究以糖、酯、核酸等为底物的酶.就功能而言，可以研究控制药物释放的水凝胶降解机制，开发响应于多个酶，按需求控制多种药物释放时间的酶响应型水凝胶，最终建立多重响应、时空可控的酶响应型水凝胶系统。