《AFM》抗生素衍生碳纳米点修饰水凝胶增强ROS损伤生物膜抗感染

研究背景

因受伤或疾病造成的严重皮肤损伤都容易受到致病菌的影响，这往往会导致严重的甚至危及生命的皮肤感染，对人类的整体健康构成了巨大威胁。侵入伤口的病原体往往会粘附并聚集在伤口或敷料表面并形成生物膜，抵抗抗菌药物的渗透，导致严重的炎症反应和难以治愈的伤口。传统的抗生素治疗是迄今为止治疗感染的主要临床方法，但因为细菌的耐药性受到限制。因此，避免生物膜引起的严重细菌感染和耐药性，取代抗生素的治疗方法显得尤为重要。

纳米材料因涉及多种抗菌机制，作为抗生素的有效替代品，有望治疗耐药细菌感染。一些具有抗菌和抗生物膜活性的金属和金属氧化物纳米颗粒已被报道。然而，不可忽视的内在毒性和由重金属离子释放引起的代谢问题使其广泛使用具有挑战性。碳纳米点是一种新型的碳基纳米材料，具有良好的生物相容性，在生物医学领域具有广泛的应用前景，特别是其独特的光敏活性和光动力治疗(PDT)中的其他有利材料特性而受到广泛关注。PDT是一种很有前景的对抗细菌和抗生物膜感染的策略，因为它产生的活性氧(ROS)会破坏细菌细胞中的生物分子，从而导致细胞死亡。例如，石墨烯纳米点在光激发下产生自由基，表现出明显的光毒性，这也证实了由电子-空穴对产生的光诱导ROS的形成。此外，有报道称，抗生素衍生的碳点（CDs）显示出有效的抗菌活性，这与某些官能团的保留和煅烧后CDs的阳离子性质有关。然而，这种小分子药物衍生CDs的复杂成分难以理解，伤口粘附性差导致疗效欠佳，这限制了它们进一步的应用。阳离子瓜尔胶(CG)是一种水溶性半乳甘露聚糖，具有丰富的侧链羟基和季铵盐基团，因其优越的生物相容性和良好的伤口粘附性而常被用作医用伤口敷料。据报道，CDs可以提高水凝胶的机械强度，这将大大促进CDs作为生物活性成分在抗菌水凝胶领域的应用。

在本研究中，卡那霉素衍生的碳纳米点(KCDs)具有抗生素和光动力活性。这些CDs在感染伤口区域表现出良好的抗菌和抗生物膜作用。KCDs不仅保留了卡那霉素的活性结构，而且还在其表面产生了五种新的修饰成分，通过分子模型评估了KCDs的各种成分与细菌β -酮酰基-ACP-合成酶III (FabH)的键接。KCDs的光动力激发可产生高浓度的活性氧，从而增强其抗菌和抗生物膜活性。因此，通过KCDs和CG之间的非共价相互作用自组装成可注射和自修复的CG-KCDs水凝胶，具有显著的抗感染能力，且不会诱导细菌耐药性。机理研究表明，CG-5‰KCDs (CG-KCDs)水凝胶在激光照射下通过产生活性氧增强对生物膜的损伤表现出了高效的抗菌活性，转录组测序和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测试进一步证明，CG-KCDs水凝胶光动力激发产生的高浓度ROS可显著下调生物膜形成的基因，上调促进生物膜分解的基因表达。此外，在该研究中，CG-KCDs水凝胶在促进伤口愈合和组织重塑方面的光动力治疗效果已通过体内伤口感染模型和免疫组织化学得到证实，在激光照射下，CG-KCDs水凝胶在体内也表现出优异的抗感染效果，并能有效促进感染小鼠的伤口愈合。

值得注意的是，CG-KCDs具有极低的细胞毒性和体内毒性。该研究结果也验证了KCDs作为有效抗菌剂取代抗生素作为抗感染策略的潜力。

研究内容

图1 在不同温度下制备的KCDs的表征。

小分子药物衍生的CDs表现出优异的生物活性，这引起了人们对抗生素衍生CDs的极大兴趣。在特定的情况下，来源于氨苄青霉素（β-内酰胺类抗生素）、红霉素（大环内酯类抗生素）和诺氟沙星（喹诺酮类抗生素）的CDs的抗菌活性显著降低或完全丧失，这是因为在相对较高的温度下，抗生素的抗菌基团或结构的被破坏。与众不同的是，通过在160℃和220℃之间煅烧获得的KCDs表现出显著增强的抗菌活性，并且根据报道，在220℃下煅烧2小时的KCDs具有最高的抗菌活性。此外，290 nm（OD290）处的光密度值增加可以清楚地看出KCDs的产率与煅烧温度呈正相关。在220℃下煅烧硫酸卡那霉素获得的KCDs的产率约为39.1%。通过在160-220℃下煅烧获得的KCDs具有纳米点结构，其尺寸分布在2至8 nm之间。高分辨率透射电子显微镜表明，KCDs几乎是球形的，晶格间距≈0.334 nm，与石墨（002）的晶面间距相符。然而，随着煅烧温度的升高，KCDs的粒度显著增加并且发生团聚。使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪来检测硫酸卡那霉素和KCDs之间的差异性，当煅烧温度低于220℃时，保留了KCDs在3341.89 cm−1的典型的O-H拉伸振动峰，1143.38 cm−1处S=O的峰，1031.95 cm−1处的C-O-C的峰为和在1541.26 cm−1处的N-H弯曲振动峰；这些特征峰在较高的煅烧温度下几乎没有。这表明卡那霉素的化学结构在高温煅烧过程中受到严重破坏，并导致其失去抗菌活性，硫酸卡那霉素的TG（热重）曲线显示，在大于220℃时，其重量开始迅速下降，DSC曲线上出现吸热峰，表明大于220℃硫酸卡那霉素的结构开始分解，KCDs表现出激发波长依赖性的荧光发射光谱，最佳激发波长为400 nm。此外，220℃下煅烧获得的KCDs的表面ζ电位为+6.1 mV，而在260℃下表面氨基损失，煅烧的KCDs的ζ电位是负的。阳离子抗菌可以通过静电吸引增强对细菌的渗透性，并降低产生耐药性的风险，因为它们基于的是物理电荷之间的相互作用，而不是针对特定阶段的代谢途径。KCDs的X射线衍射图显示了一个中心位于2θ≈23.5°宽的峰，，对应于石墨的结构（002）晶面。此外，能量色散X射线光谱（EDS）和X射线光电子能谱（XPS）分析也表明了KCDs中的四种元素（C、O、N和S）。因此，在较低温度（160–220℃）下制备的KCDs表现出更显著的抗菌活性，因为此温度下会保留卡那霉素的部分化学结构。

图2 CG-KCDs水凝胶的制备与表征。

接下来，在不使用任何交联剂或催化剂的情况下，通过氢键合成水凝胶敷料，CG中的活性羟基和侧链中的氨基之间可以形成氢键，此外，CG中的活性羟基和KCDs的表面氨基使得氢键增加，可以在持续搅拌下合力形成可注射和自修复水凝胶。CG-1‰的KCDs、CG-2.5‰的KCDs和CG-5‰的KCDs表现出孔隙大小为数十微米的多孔和互连结构，这可能赋予敷料良好的透气性。然而，在没有KCDs的CG中没有观察到明显的多孔结构，这表明添加KCDs后水凝胶的交联密度更高。EDS元素图谱清楚地表明了水凝胶中C、O、N和S的均匀分布，XPS分析表明，水凝胶由C1s、O1s、N1s和S2p峰组成。C1s峰在283.4、284.3、285.1和286.3eV处的峰分别对应于C-C/C-C, C-N/C-S, C-O, 和C=O官能团。CG-KCDs的N1s光谱在398.2和401.1 eV处显示出两个峰，分别归属于吡啶N和石墨N，其中的石墨N结构是在高温下硫酸卡那霉素形成的碳核。S 2p峰在166.5和167.9 eV处分为两个峰，这归属于-C-SOn-（n＝2，3），例如硫酸盐、亚硫酸盐或磺酸盐。CG-KCDs中的S来源于前体硫酸卡那霉素。此外，使用FTIR分析水凝胶的表面官能团。在3493.94和1567.18 cm−1处的峰值分别代表了CG的O-H拉伸振动和N-H弯曲振动，而CG-KCDs中O-H（≈3416.31 cm−1）拉伸振动和N-H（≈1547.26 cm−1）弯曲振动的红移可能是氢键的形成引起的。这些结果表明，KCDs和CG可以通过氢键自组装形成水凝胶。由于在特定的环境中会破坏这些非共价键，故CG-KCDs之间的连接可能会在伤口或生物膜微环境中降解并释放KCDs。为了了解激光照射下光激发KCDs诱导ROS产生的机制，该研究使用电子自旋共振（ESR）光谱检测了用4-氧代-2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基（4-氧代-TEMP）和2，2，6,6-四甲基1-哌啶氧氧基（TEMPO）捕获的单线态氧（1O2）和羟基自由基（•OH）。在激光照射KCDs和CG-KCDs（1 W，405 nm）后，检测到4-氧代-TEMP/1O2络合物和DMPO/•OH络合物的特征光谱，水凝胶CG的结构对ROS的产生没有显著的影响。ESR光谱揭示了一个以g=2.003为中心的洛伦兹形状的KCDs非成对电子信号，这进一步证实了氧空位的存在。g值是一个取决于自由基性质的常数，具有氧空位的材料g≈2.003。氧空位介导的能量转移可以在激光照射下高效产生1O2。此外，电子-空穴对可以与之吸附的氧分子反应，超氧化物歧化酶试验也（SOD，O2•−的特异性清除剂）证实了这一点，有效降低了1O2的ESR信号，基于这些结果，可以推测光激发KCDs通过能量转移和电子转移途径产生1O2和•OH。

图3 CG-KCDs水凝胶的流变性能。

作为伤口敷料，水凝胶必须具有高粘度、可注射性和自我修复的物理特性，才能治疗各种类型的伤口；这将提高它们的有效性和适用性。在本研究中，系统地研究了CG-KCDs水凝胶的物理性质。首先，动态应变测试结果表明，CG和CG-KCDs水凝胶在固液状态下的临界点为100%应变处，使用动态应力应变测试来检查水凝胶的自修复能力。在比临界点高四倍（≈400%）的动态应变下，CG-KCDs水凝胶的G’值低于其G”值，这表明水凝胶网络结构塌陷，当动态应变恢复到≈1%时，G’值迅速增加，并变得远大于G”，水凝胶网络结构恢复。值得注意的是，即使在三次交替循环后，凝胶性能也可以恢复，这表明CG-KCDs水凝胶自修复能力较为显著。同时，在0.1至100 rad s−1逐渐增强的频率下，CG和CG-KCDs的G’值总是大于G”值，这说明了CG基水凝胶的优异机械性能。此外，当剪切速率从0.1增加到100 s−1时，CG-KCDs水凝胶的粘度急剧下降，这表明水凝胶具有优异的可注射性。

此外，作者设计了几个使用场景，使用注射器将CG-KCDs水凝胶连续注射到水中或培养皿中，分别形成凝胶柱或“AAU”字体，证实了水凝胶的可注射性。此外，填充在CG-KCDs水凝胶孔中的若丹明6G在2小时内扩散到空白水凝胶中，这证明了多孔结构水凝胶的载药能力。作者认为水凝胶有效承受拉伸和自愈的能力可归因于其稳定的氢键和静电力的非共价相互作用。在拉伸过程中，超过100%的伸长率不会影响CG-KCDs水凝胶的完整性，并且裂解的CG-KCDs凝胶能够在1小时后自愈合。结果表明，CG-KCDs水凝胶具有良好的延展性和自修复能力。由于水凝胶具有良好的延展性和高粘度，实验者在关节处涂抹凝胶后能够在紧密粘附在不同弯曲程度的手指关节处。总之，证明了这种水凝胶作为关节创伤敷料的实际应用。

CG基水凝胶的降解速率和KCDs的体外释放速率直接影响水凝胶的抗菌性能并促进组织修复。CG-KCDs水凝胶在pH 7.4或6.0的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中吸水膨胀，且在微酸性环境中膨胀更快有助于药物释放。正如预期的那样，KCDs在酸性条件下释放得更快，第一天和第三天的累积释放量分别为≈42.5%和67.4%，这有助于它们在感染伤口的酸性微环境中快速反应。由于KCDs的吸水、溶胀和快速释放，水凝胶的拉伸强度和断裂应变都显著降低，水凝胶在pH 7.4或6.0的PBS中降解1或3天后的扫描电子显微镜（SEM）图像所示，它在微酸性条件下经历快速的结构变化，这表明3天后结构发生了实质性的坍塌。这些性质可以促进水凝胶的降解。一般来说，众所周知，伤口的细菌感染越严重，酸性环境就越明显。因此，CG-KCDs水凝胶有望根据伤口感染的严重程度自动调节细菌感染部位KCDs的释放。

图4 CG-KCDs水凝胶的体外抗菌性能。

此外，作者评估了CG-KCDs水凝胶的抗菌能力，KCDs表现出比硫酸卡那霉素更强的抗菌活性；此外，抗菌活性通过激光照射进一步增强，在用纯CG水凝胶或单独激光照射处理后，大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的生长曲线表现出典型的“S”形，这表明抗菌活性可以忽略不计。相反，CG-KCDs水凝胶有效抑制细菌增殖，激光照射后抗菌效果显著改善。此外，使用菌落形成单位（CFU）方法检测水凝胶的抗菌活性，CG-KCDs（激光）组表现出最显著的抗菌活性，而大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的CFU数量减少了三个数量级以上。使用活/死细胞测定法进一步研究了水凝胶的抗菌效果。对照组的细菌表现出明显的绿色荧光，相反，在CG水凝胶中添加KCDs后，红色荧光逐渐增加，CG-KCDs（激光）治疗组具有最强的红色荧光和几乎不可见的绿色荧光，反映了对两种细菌的根除效果。通过SEM进一步表征了基于CG的水凝胶处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形态的变化，单独激光处理后，在细菌表面观察到轻微的皱纹，在激光照射下，随着KCDs在水凝胶中的掺杂，细菌形态进一步缩小，直到细菌壁和细菌膜被完全破坏。通过邻硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷（ONPG）水解试验和3,30-二丙基噻二碳花青碘化物（DISC3-5）荧光显色试验进一步探讨了细菌膜渗透性的变化。当细菌细胞膜被破坏时，细菌内部的β-半乳糖苷酶被释放到细胞外。β-半乳糖苷酶分解ONPG产生邻硝基苯酚（ONP），可在420 nm（OD420）的光密度下检测到。CG-KCDs（激光）治疗组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的OD420值分别为≈0.145±0.008和0.176±0.010，显著高于对照组（分别≈0.009和0.011）和单独激光治疗组（分别约0.017和0.026）。这些结果表明，CG-KCDs和CG-KCDs（激光）导致细菌细胞膜的通透性显著增加，表现为β-半乳糖苷酶向细胞外空间的大量释放，DISC3-5探针在完整的细菌中没有荧光显示；然而，并表明细胞膜受损的细菌被释放出来而发出强烈的绿色荧光。与之前的结果类似，用CG-KCDs（激光）处理后，细菌的绿色荧光水平显著增加。这些结果证实，CG KCDs（激光）通过破坏细菌壁和膜，同时伴有细胞质渗漏和可能的DNA损伤，表现出最显著的抗菌作用。

KCDs对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制能力远高于硫酸卡那霉素，这与KCDs产生的新的抗菌机制有关。这一新机制主要包括诱导细菌活性氧的急剧爆发，从而减缓细菌耐药性的发展。这种新的抗菌机制可能与KCDs的表面化学有关，因此阳离子KCDs可以通过静电吸引增强对细菌的渗透，而ROS可以对细菌造成氧化损伤，而不是靶向代谢途径的特定阶段，这将降低产生耐药性的风险。此外，发现KCDs产生的ROS对细菌生物膜清除之后有助于改善药物渗透和增强抗菌活性。然而，硫酸卡那霉素并没有表现出KCDs的这些特性。特别是激光处理可以激发KCDs产生更多的ROS，这是KCDs（激光）具有更高抗菌和抗生物膜活性的原因。

图5 CG-KCDs（激光）水凝胶诱导的ROS爆发和抗生物膜特性。

KCDs本身仍然表现出强大的抗菌活性，即使是对对硫酸卡那霉素产生耐药性的细菌，这可能与KCDs的新抗菌机制有关，越来越多的证据证实，活性氧诱导的氧化应激损伤是一种与细胞膜损伤相关的有效抗菌机制，与对照组相比，纯CG水凝胶或单独的激光处理不会诱导细菌ROS的爆发，不足以对细菌造成损伤。然而，CG-KCDs水凝胶处理后，细菌内源性ROS水平显著增加，表现为绿色荧光显著增强。由于光诱导水凝胶中KCDs产生电子-空穴对，生成了额外的ROS；这就是CG-KCDs（激光）优异抗菌能力背后的驱动力。值得注意的是，N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）是一种高效的ROS清除剂，可显著减少CG-KCDs水凝胶诱导的ROS的产生，作者利用此特点这研究ROS对生物膜的影响。

扫描电镜图像证实，细菌可以在盖玻片表面形成致密的生物膜，从而逃避抗菌药物的渗透和清除，相反，在CG-KCDs和CG-KCDs（激光）处理后，盖玻片表面的生物膜密度显著降低，并且抗生物膜活性似乎与ROS浓度呈正相关。此外，在NAC清除ROS后，CG KCDs（激光）对生物膜的影响显著降低，这证实了ROS对生物膜形成的潜在影响。生物膜中生物量的定量检测与上述观察结果一致，CG-KCDs（激光）处理后，与对照组相比，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生物膜中胞外多糖（EPS）的成分别减少了4.1倍和5.9倍。然而，随着ROS的清除作用，EPS的产生显著增加，这表明ROS阻碍了生物膜中EPS的产生。3D激光共聚焦图像清楚地表明，对照和激光处理的盖玻片被生物膜覆盖，生物膜上有密集的活细胞。然而，CG-KCDs（激光）处理后，生物膜的密度和结构被显著破坏，几乎所有细菌都死亡。因此，CG-KCDs可以作为一种有效的抗菌材料，通过激光诱导的ROS爆发来抑制生物膜的形成。

图6 ROS影响CG-KCDs水凝胶抗生物膜活性的分子机制。

为了研究ROS激活的抗生物膜活性的分子机制，使用转录组测序来定位CG-KCDs（激光）处理的金黄色葡萄球菌组和对照组之间的差异表达基因（DEG），与对照组相比，CG-KCDs（激光）治疗组中825个DEG上调，149个DEG下调。DEG的GO功能富集分析结果如图所示，细胞生物合成过程、细胞氨基酸代谢过程和核糖体结构成分等相关途径的Q值最高，表明CG-KCDs（激光）处理对细菌的生物合成和代谢有显著影响。这些结果与体外抗菌结果一致。此外，我们还进行了KEGG通路富集分析，发现CG-KCDs（激光）处理对与生物膜和细胞壁合成相关的途径具有显著的调节作用。为了进一步说明CG-KCDs（激光）对生物膜的影响，对富集的生物膜相关DEGs进行了热图分析。群体感应调节的agr家族基因（agrA和agrC）均显著上调；促进生物膜形成的基因（icaA/icaB/icaD）显著下调，并且负调节基因icaR被上调。通过RTq-PCR进一步验证了经典基因在agr和ica家族中的表达，需要注意的是，在去除细菌产生的ROS后，与agr和ica家族相关的基因的表达水平与对照组相似，这表明ROS可以通过调节生物膜形成基因（ica家族）和群体感应调节基因（agr家族）来抑制生物膜的形成。总之，金黄色葡萄球菌在agr和ica家族基因分别低表达和高表达的条件下更有可能形成生物膜。CG-KCDs可以诱导细菌在激光照射下产生高浓度的ROS，这不仅会对细菌DNA或蛋白质造成直接损伤，还会激活和抑制agr和ica家族基因的表达，高表达的agr家族基因通过上调生物膜降解酶来启动生物膜分离过程。生物膜的破坏使细菌能够重新获得对抗菌药物的敏感性，这对于彻底杀死细菌和防止细菌耐药性的发展至关重要。

图7 ROS影响CG-KCDs水凝胶抗生物膜活性的分子机制。

所描述的抗菌作用促使我们研究KCDs的特定结构。由于小分子药物衍生的CDs的组成复杂，很难确定其组成。然而，表面具有非晶壳层和晶核的纳米结构已被广泛接受，所形成的表面基团对CDs的功能有很大影响。在该研究中，我们使用高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）分析了KCDs的组成和可能的化学结构，并使用分子对接方案评估了每种化合物对金黄色葡萄球菌FabH的潜在影响。KCDs表现出与硫酸卡那霉素相同的一些液相和质谱峰，这表明KCDs保留了硫酸卡那菌素的部分原始结构，经过高温处理后，KCDs包含了几个全新的结构，如图所示，化合物（1）和（2）是通过在高温下破坏卡那霉素的醚键去除a-和c-环而形成的；化合物（3）和（4）是通过c环与b环氨基分离后的脱水形成的；化合物（5）是化合物（4）脱甲基和脱水后互变异构的产物。因此，在硫酸卡那霉素的煅烧过程中形成了碳核，并保留了一些原始结构。此外，我们的分析表明，由于某些醚键的断裂、脱水和脱氨基作用，衍生出了某些新化合物。这些新化合物修饰了KCDs的表面，从而发挥了它们的生物活性。

脂肪酸是细胞膜的重要组成部分。脂肪酸合成的抑制可以干扰细菌细胞膜和生物膜的形成，从而抑制细菌的生长和繁殖。FabH控制细菌脂肪酸合成的起始。因此，我们使用分子对接技术来可视化FabH和上述五种化合物之间相互作用的可能结合模型，在检查的化合物中，化合物（1）、（3）和（4）的羟基和氨基与活性袋周围的Gly83和Met85形成了典型的氢键，结合能分别为−15.245、−14.763和−13.904 kcal moL−1，小分子化合物和周围氨基酸之间的大量范德华相互作用进一步促进了与蛋白质的结合。相反，化合物（2）和（5）具有较低的结合能，这表明这些配体不利于与FabH形成键合相互作用以抑制酶活性，该结合模型表明，化合物1、3和4与FabH活性袋形成的氢键和范德华力是KCDs对FabH的有效抑制的原因。

图8 CG-KCDs的体内抗菌、抗炎和促进伤口愈合。

使用小鼠伤口感染模型进一步研究了基于CG的水凝胶的体内抗菌效果，感染和治疗方案如图所示。图像记录了不同治疗组小鼠在10天内的伤口愈合过程，伤口愈合和伤口愈合率的示意图分别如图所示。所有受试小鼠的伤口大小随着时间的推移逐渐减小。第10天，用CG KCDs（激光）治疗的伤口几乎完全愈合（≈8.4%），并观察到新的皮肤组织。对照组、CG水凝胶治疗组和CG-KCDs水凝胶治疗组的小鼠伤口大小分别为≈49.5%、39.2%和27.2%。这些结果表明，CG-KCDs的抗生素样活性和激光诱导的ROS释放足以在短时间内杀死细菌，并在长时间内抑制伤口部位的细菌增殖。应该注意的是，ROS的这种短暂释放对伤口愈合没有显著的负面影响。总之，CG-KCDs（激光）水凝胶促进了伤口界面的抗菌活性，并作为临时皮肤屏障，有利于伤口愈合和皮肤组织重塑。

感染伤口愈合伴随着复杂的生物学过程，包括细菌感染、炎症、增殖和重塑。为了验证水凝胶对上述过程的影响，我们通过检查组织学变化来评估伤口愈合的进展。苏木精-伊红（H&E）染色表明，在对照组的皮肤组织中观察到一些炎症细胞，并且在CG-KCDs水凝胶处理后，炎症细胞的数量减少。相反，在CG-KCDs（激光）治疗组中，炎症细胞几乎不可见；与其他处理相比，一些新的上皮细胞和结缔组织排列更整齐，并观察到一些类似毛囊的新结构。此外，炎症标志物IL-1β和凋亡细胞（TUNEL）的染色结果表明，在CG KCDs（激光）治疗后，伤口中IL-1β的表达和凋亡细胞数量显著低于其他组。胶原蛋白是真皮组织细胞外基质的主要成分，在伤口愈合过程中发挥着非常重要的作用。因此，使用Masson染色来评估水凝胶处理对伤口组织中胶原水平的影响。在治疗后第10天，CG-KCDs（激光）治疗组的胶原沉积显著高于其他组，其次是CG-KCDs水凝胶、CG水凝胶和对照组。此外，CG-KCDs（激光）治疗组CD31的表达显著高于其他三组，血管直径更大，可以观察到清晰的管腔结构。这些结果表明，CG-KCDs（激光）水凝胶促进了感染伤口的血管生成，在第10天通过Ki67染色进一步评估伤口组织中的细胞增殖活性。对照组和CG水凝胶组的Ki67表达水平显著高于CG-KCDs和CG-KCDs（激光）水凝胶组。随着伤口组织愈合程度的增加，伤口从增殖期发展到重塑期，这解释了CG-KCDs（激光）水凝胶处理组中Ki67表达降低的原因。应该注意的是，在迅速进入重塑期的组织中Ki67表达的降低可以抑制异常组织增殖。最重要的是，激光照射下，CG-KCDs水凝胶的高效抗菌活性降低了的伤口中的感染程度。此外，在激光照射下，CG-KCDs水凝胶表现出优异的抗炎、抗凋亡、胶原再生、血管生成和组织增殖抑制能力，显著促进伤口愈合和组织重塑。

图9 CG-KCDs水凝胶优异的细胞相容性和生物安全性。

胚胎成纤维细胞在坏死和组织损伤的修复中发挥着重要作用，作者首先在体外评估了CG-KCDs水凝胶对哺乳动物胚胎成纤维细胞的潜在毒性，活/死细胞染色测试表明，用CG基水凝胶处理的细胞具有绿色无刺状结构，红色的死细胞几乎看不见；这些结果与对照组的结果相似。细胞计数试剂盒（CCK-8）细胞活力测试证实，CG基水凝胶的细胞活力在治疗1天后保持>95%，并且细胞在治疗3天后显著增殖，此外，通过将红细胞与基于CG的水凝胶共同孵育来评估它们的血液相容性。在激光照射或不照射的情况下，CG基水凝胶的溶血活性与对照组相似，表明CG基水凝胶具有优异的血液相容性。用CG-KCDs水凝胶处理的小鼠的体重显示出稳定且轻微的增加，与对照组相似，此后，收集对照组和CG-KCDs水凝胶处理组小鼠的血液和主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏），用于评估水凝胶毒性。连续治疗15天后，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸酐（CREA）、尿素氮（BUN）、胆固醇（CHOL）和血糖保持稳定。结果表明，CG-KCDs水凝胶具有较高的生物安全性，对肝脏和肾脏没有显著影响。小鼠主要器官的H&E染色显示主要器官没有炎症损伤，因此，含有KCDs的CG基水凝胶的高细胞相容性和生物安全性可能使其成为伤口治疗敷料的合适候选材料。

总结与讨论

在该研究设计和制备了一种具有抗生素和光动力活性的卡那霉素衍生的碳纳米点（KCDs）。HPLCMS分析表明，KCDs不仅保留了卡那霉素的活性结构，而且产生了五种新的化学成分。分子对接结果表明，化合物（1）、（3）和（4）的羟基和氨基通过氢键与金黄色葡萄球菌FabH活性袋周围的Gly83和Met85稳定结合，抑制酶活性。此外，KCDs的光动力激发通过电子-空穴对和氧空位产生高浓度的羟基自由基和单线态氧，以增强细菌的氧化损伤。因此，通过非共价力将KCDs与CG交联，制备具有注射和自我修复性能的多功能水凝胶伤口敷料。所设计的CG-KCDs水凝胶以pH响应的方式快速释放KCDs，并通过破坏细菌细胞壁和细胞膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出优异的体外抗菌活性。抗菌机制表明，CG-KCDs（激光）水凝胶诱导细菌ROS爆发，并表现出显著的生物膜清除能力。转录组测序和RT-qPCR测试表明，CG-KCDs（激光）水凝胶产生的高浓度ROS显著下调了促进生物膜形成的相关途径，并激活了agr家族基因的表达，以加速生物膜损伤。此外，在小鼠伤口感染模型中，用CG-KCDs（激光）水凝胶处理的伤口显著减少了凋亡细胞和炎症浸润，这导致胶原沉积和微血管重塑加速，从而促进伤口愈合。用CG-KCDs（激光）水凝胶治疗的伤口表现出最规则的上皮细胞和结缔组织，丰富的类似毛囊的新结构，以及低组织增殖。总之，KCDs是设计具有双重抗生素和光动力活性的碳纳米点的合适候选者，而其衍生的CG-KCDs水凝胶具有显著的抗菌、抗生物膜、抗炎和促进伤口愈合的特性，使其成为伤口治疗的优秀敷料。