绘制诱导多能干细胞正向编程巨核细胞的生物发生

文丨十二楼的德安

编辑丨十二楼的德安

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前言

血小板是负责凝血的细胞。在英国，每年有280,000个血小板单位被输注到血小板计数低的患者体内，以防止出血。大多数患者在癌症治疗或造血系统恶性肿瘤后出血或骨髓功能不全后接受血小板输注。

血小板单位是从捐赠者那里收集的，并与ABO血型和恒河猴D相匹配。以前的输血接受者和经产妇女可能会对血小板表面的外来主要组织相容性复合体I类或其他抗原产生免疫力，从而使匹配过程更加复杂。

血小板的保质期仅为5至7天，供体可用性有限，这意味着血小板是所有血液成分中最不稳定的供应链，可能会出现短缺。

巨核细胞是大型多核多倍体细胞，可与骨髓中的造血干细胞分化。MK占有核骨髓细胞的0.01%至0.03%，据估计它们每天共同产生1×1011至2×1011个血小板。

长期存在的HSC分化模型是一个分层模型，其中HSC分化形成多能祖细胞，它经历转运放大分裂并可以产生所有成熟的血细胞。

随着这些细胞分化并在MK分化的过程中受到更多谱系的限制，共同髓系祖细胞形成，随后分化成为MK红细胞祖细胞，后者仅限于MK和红细胞生成。

MK祖细胞与MEP不同，只能形成MK。这些最初是在由动员的外周血衍生的CD34+细胞产生的人类MEP中观察到的。

MKPs保留很少的产生红细胞的能力，并且几乎只在集落形成试验中产生MKs。它们表达MK相关蛋白，如CD41、CD61、VWF、CLU和NF1B，CD42表达预示着红细胞集落形成潜力的消失。

使用scRNA-seq在体外映射MK分化

为了了解MK体外分化的过程，在MK分化方案的前10天每24小时固定A1ATD1细胞进行，并且在MK成熟时的D15和D20固定。还设计了一种独特的转基因指纹识别策略，细胞在三种慢病毒转录因子的帮助下分化，稳定地插入基因组。

它们的下游慢病毒序列允许使用专门设计的引物从cDNA扩增其转录物，这些引物在目标富集过程中取代了VJ引物。这允许概述这些祖细胞的基因表达以及催化它们形成的转基因数量。

所有细胞都投影在统一流形近似和投影上，按时间点着色。Seurat检测到51个簇，设置Monocle以找到相同数量的簇。一组聚类标记和富集术语用于评估聚类身份和功能。

iPSC位于UMAP的左上角，分为三个簇，其中主簇的效力最高，表达了更高水平的初始状态和启动多能状态的标记。当细胞离开簇2时，它们失去了多能性相关标记的表达并获得了中胚层身份，表达HAND1。

细胞分叉到两条路径上。第一个向UMAP图的底部发展，并表达更高水平的线粒体转录本。当细胞在D10上与粘附培养物分离时，其中一些细胞在底部发生凋亡。

其他细胞表达上皮标志物，如KRT8、KRT18和KRT19，表明它们朝着上皮命运移动。当细胞在D10时解离时，这些细胞会丢失。第二个细胞分支向图表的中心部分发展，并表达与造血作用和生血内皮相关的经典标记，例如CD34、KDR、CDH5和PECAM1。

GATA1和TAL1造血转录因子也在这个阶段表达。从D9开始，细胞向右上角的红细胞身份转变，以GYPA为特征、血红素和卟啉合成以及铁代谢。

随着这些细胞成熟并向图的顶部移动，它们获得了血小板相关的转录本，例如ITGA2B，并最终成为表达GP1BA和高水平FLI1的成熟MK。

期望从培养的早期时间点发现MKP，因为产生MK的细胞在D10之前就已经存在。MKP还应坚持到课程结束，因为它们支持长期文化。MKP应该存在于包含来自多个时间点的细胞的簇中，例如造血内皮簇或红细胞簇，它们都包含从D8到时间过程结束的细胞。

使用单细胞方法识别MKP标记

假设MKP具有比周围培养物更具增殖性的转录特征，并且必须在成熟的MK培养物中找到。为了对此进行研究，使用Smart-Seq方案对来自培养物的192个单细胞进行了测序。增加的测序深度使能够研究可能的细胞表面相关标记，这些标记可用于从混合培养物中纯化MKP。

在数据过滤和分析之后，使用Monocle识别了三个簇。转录本富集分析使能够识别以较低水平表达ITGA2B的中间MK、具有高ITGA2B表达的成熟MK和凋亡细胞。发现第一个集群最有趣，因为它的成熟度较低。

对每个簇的前25个标记进行了基因集富集分析。在簇1中富集的所有44个富集项都参与了DNA复制，其中E2F是最富集的转录因子。这表明该集群具有高度复制性，因此可能包含MKP。

检查了在推定的祖细胞簇中富集的转录本，并选择了那些高度表达和细胞表面相关的转录本作为推定的MKP标记的标准。在潜在标记物中，选择了MHCI类相关肽B和脊髓灰质炎病毒受体。

为了研究分化过程中的蛋白质表达，在MK分化过程中对细胞表面MICB和PVR进行了流式细胞术。MICB和PVR在分化的第9天由较高比例的细胞表达，并随着MK在D20达到成熟而减少。

为了在D9之前获得更好的表达水平分辨率，在早期分化期间通过定量聚合酶链反应评估标记的转录水平。MICB和PVR转录物水平在分化的第2天达到峰值并在此之后降低，再次表明它们可以标记早期祖细胞状态。

为了研究这些标记是否在功能上定义了MKP，进行了20种索引分类。MICB和PVR都强烈富集形成集落的细胞。CD41也强烈富集集落形成细胞，而CD42的作用要弱得多。

这些指标分类的结果表明MICB和PVR的细胞表面表达与MK集落形成能力相关，这两种表面蛋白可以标记大量培养物中的MKP。

为了确认该结果，进行了菌落形成单位测定。MICB+或PVRlo、PVRmed或PVRhi细胞是从D75A1ATD1MK培养物中分选出来的，CD41+>86%。

将分选的细胞接种在甲基纤维素CFU测定中，并与未选择特定标记的分选活细胞进行比较。十天后，对菌落进行评分。

MICB+细胞形成的集落是活体分选细胞的四倍多，表明MICB标记了MKP。PVR表达水平也与集落形成相关。个人录像机嗨细胞形成的菌落数是对照的两倍多。

当收集用于流式细胞术分析时，所有菌落都具有一致水平的CD41表达，表明MK的稳健形成。来自MICB+或PVRhi细胞的集落比其他集落表达更高的CD42。

进一步完善MKP标记：已建立文化的单细胞快照

MICB和PVR在分化时程的10xGenomics测序中检测得非常差，尽管在流式细胞术测量时在蛋白质水平上表达良好。假设来自10x数据集的更高表达的标记可用于进一步完善MKP面板。

ANXA1在簇11中富集，簇11直接位于簇15速度图的下游，朝向成熟的MK。从簇6突出的簇与体内人类MKP具有最高的同源性，并且HMMR和ITGAV似乎在该区域得到丰富。

为了确定这些新标记是否确实在MKP中表达，从成熟的D27A1ATD1MK培养物中纯化了CD41+细胞，并使用单细胞10x基因组学工作流程和转基因表达量化对MICB+PVRhi细胞进行了测序。通过质量控制的1661个细胞被分成13个簇并绘制在UMAP上。

转基因测序显示在所有三个感兴趣的簇中GATA、TAL1和FLI1的表达更高。然后查看了四个候选者从UMAP时间过程中识别，ANXA1标记了簇1，并且也在簇7和8中弱表达。HMMR标记为簇2。

ITGAV以低水平广泛表达，而检测到非常少的FLT1表达，除了簇1中的少数细胞。所有这些表面蛋白与MICB和PVR的一种或组合可以改进在培养系统中精确定位MKP的策略。

随机森林特征选择识别有区别的MKP标记

菌落形成最显着的标记是PVR，其次是MICB，证实了之前的菌落形成结果。CD41和CD168紧随其后，每一个重复的中位等级为1。CD51在两次重复中排名中位数为2。ANXA1表现不佳，似乎与MKP状态无关。当用作阴性标记时，它进一步纯化了所有其他标记选择的种群。

为了确定大多数选择性所需的截止值，所有数据集在异常值排除和归一化后合并。合并后的数据集被分为60个箱子，每个箱子中的菌落和非菌落得分，允许计算每个箱子的菌落形成。然后将变量绘制为每个bin+具有更高标记表达的bin中细胞累积比例的函数。

当包括表达水平越来越低的细胞时，CFU的百分比会降低到与包含所有细胞的整体水平相对应的基线。每个标记的最佳截止点由每个图形的拐点标记。

对于阳性标记，使用截止值以下的细胞，但由于VEGFR1是阴性标记，使用截止值以上的细胞。由于PVR被列为索引排序数量最多的第一个标记，因此首先绘制PVR。

选择前20%的PVR表达细胞选择了大多数MKP。然后将数据集子集化为仅包含表达该PVR水平的细胞，并使用其他标记进一步细化，从单个索引排序中按P值的递增顺序。

选择前50%的MICB表达细胞、前85%的CD51表达细胞、前62%的CD168表达细胞和后25%的VEGFR1表达细胞纯化了最高比例的总菌落。最终面板随后在所有数据集上分别进行了测试，优于由决策树或随机森林分析生成的所有其他标记面板。

使用ITGAV、HMMR和FLT1的基因表达数据，随后在时程UMAP上精确定位了MKP。这些细胞位于轨迹分析中导致成熟MK簇的簇中，在它们的时间点中表达最高的FLI1水平，并包括簇6的区域，该区域与体内MKP。

结论

以高分辨率绘制了从iPSC到成熟MK的MK分化，生成了分化过程中获得的细胞命运的概览，并证明该方案准确地生成了MKP和红系祖细胞，它们反映了它们在人骨髓中的体内对应物、外周血和脾脏。

微阵列已用于分析永生化MK系，RNA-seq已用于分析来自ESC的初始MK分化，以比较体外分化的MK与来自脐带血的CD34+的MK造血干细胞。这是第一次将体外产生的MK直接与体内祖细胞进行比较。

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