桂淼等解析运动纤毛轴丝的完整原子结构并辅助纤毛病临床诊治

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纤毛（cilia）是真核细胞表面一类凸起的细胞器，普遍存在于高等生物几乎所有细胞中，在细胞运动，胚胎发育，信号转导等过程中发挥重要作用。部分纤毛能通过水解ATP提供的能量自主运动，称为运动纤毛，如人呼吸道上皮细胞表面纤毛和精子尾巴。纤毛表面覆盖有细胞膜，中央是基于微管的骨架结构，称为轴丝（axoneme）。运动纤毛的轴丝为经典的“9+2”结构，包括九根双联微管、两根中心微管及数百种附属蛋白质，其直径约200纳米，长度大于5微米，是真核细胞内最复杂的分子机器之一。运动纤毛的生长和运动由几百种蛋白质精密协作来完成，相关基因突变和结构异常可引起原发性纤毛运动障碍症 （PCD）和精子鞭毛多发形态异常 （MMAF）等疾病。

2023年5月31日，哈佛医学院Alan Brown课题组（第一作者为Travis Walton和桂淼）在Nature期刊上发表了题为Axonemal structures reveal mechanoregulatory and disease mechanisms的论文，解析了莱茵衣藻和人呼吸道纤毛轴丝的冷冻电镜结构，结合AI辅助结构预测和原子建模手段构建了轴丝的全原子模型，揭示了近200种蛋白质组装成轴丝并调控纤毛运动的结构基础；进一步解析了四种不同基因突变PCD病人来源的纤毛轴丝结构，阐明了相关突变致病的分子机制。

图1 纤毛轴丝原子模型

为探究纤毛轴丝的分子组成、组装及运动调控的分子机制，自2017年起，美国哈佛医学院Alan Brown课题组和圣路易斯华盛顿大学张锐课题组紧密合作，以莱茵衣藻、牛气管组织、人呼吸道上皮细胞为材料，先后解析了双联微管 【1-3】、radial spokes 【4】、外臂动力蛋白 （Outer dynein arm, ODA）【5】、中央微管【6】等复合物结构，极大加深了我们对纤毛及相关纤毛病分子机制的理解。相关研究以封面文章发表在Cell, Nature Structural and Molecular Biology等期刊，并被选为经典教科书Lodish Molecular Cell Biology和Chlamydomonas Source Book的封面（详见BioArt报道：Cell | 桂淼等报道哺乳动物纤毛骨架原子模型并鉴定新的致病基因——从冷冻电镜到发现新致病基因；NSMB | 桂淼/张锐等报道运动纤毛中心微管的结构；NSMB | 桂淼/张锐合作揭示纤毛运动的机械调控结构基础）。

由于轴丝结构的复杂性，除上述组分外，轴丝上仍有大量蛋白质复合物的结构未得到解析，如内臂动力蛋白（IDA）、N-DRC等，主要因为这些结构柔性大、拷贝数低。本文通过优化样品制备和冷冻电镜数据处理流程，将轴丝不同区域结构解析到3-15埃分辨率，结合Alphafold2结构预测、AI辅助建模、低分辨率cryo-ET结构信息、生化和蛋白质组学文献信息等，构建了莱茵衣藻和人呼吸道纤毛轴丝的全原子模型（图1）。该结构包括两类物种各约200种蛋白质的精确三维结构，每个96纳米重复单元包含五十多万个氨基酸残基（三百多万个原子），是PDB数据库中最大的结构之一。

通过结构分析，本文阐明了每个96纳米重复单元中7种不同IDA复合物的分子组成；揭示了IDAf、RS等复合物主要通过双联微管表面的螺旋蛋白网络锚定在微管上；N-DRC末端富含带正电的氨基酸残基主要通过与相邻微管表面富集的负电氨基酸相互作用，从而连接两根双联微管；ODA与IDAf、N-DRC等复合物通过动态物理相互作用调控纤毛运动；轴丝的结构在进化上高度保守，不同物种中其整体形态类似，同时也呈现细胞和物种特异性。

图2 PCD病人呼吸道纤毛的功能与结构分析

本文一方面极大地拓展了我们对纤毛结构和功能的认识，也有直接的临床意义，能辅助PCD等纤毛病的临床诊治。首先，本研究鉴定的近200种纤毛蛋白质是纤毛组装和运动的基础，相关基因突变可能导致纤毛组装失败和运动异常，因此本文鉴定的纤毛基因极大扩展了PCD等纤毛病的候选致病基因库，可辅助临床分子诊断。此外，通过临床合作，本研究收集了四例PCD病人的呼吸道细胞样本并进行体外培养和纤毛分离，解析了四种纤毛基因突变后轴丝的冷冻电镜结构，结合功能分析，阐明了基因突变致病的分子机制。同时，PCD病人来源的轴丝结构还进一步表明ODA和RS等结构互相独立，一种结构的丢失不影响另一种结构的组装，并且对微管内蛋白的影响很小。

本文受到了多位审稿人的高度赞赏，纤毛轴丝完整结构的解析对运动纤毛领域的意义被审稿人类比为人类基因组计划似的工作，将为后续纤毛生物学和运动纤毛病等相关研究等提供重要参考。

桂淼博士于2022年12月从哈佛医学院回国，加入浙江大学良渚实验室建立独立研究团队，任百人计划研究员和博士生导师。现诚聘博士后，专业背景不限，诚邀青年人才加入！详情可参考浙大个人主页：https://person.zju.edu.cn/miaogui

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06140-2

制版人：十一

参考文献

1. Ma et al. Structure of the Decorated Ciliary Doublet Microtubule. Cell. 2019, 179(4):909-922.

2. Gui et al. De novo identification of mammalian ciliary motility proteins using cryo-EM. Cell. 2021, 11;184(23):5791-5806.e19.

3. Gui et al. SPACA9 is a lumenal protein of human ciliary singlet and doublet microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022, 119(41):e2207605119.

4. Gui et al. Structures of radial spokes and associated complexes important for ciliary motility. Nat Struct Mol Biol. 2021, 28(1):29- 37.

5. Walton et al. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nat Commun. 2021, 12, 477.

6. Gui et al. Ciliary central apparatus structure reveals mechanisms of microtubule patterning. Nat Struct Mol Biol. 2022, 29: 483-492.