一文读懂PCR技术在寄生虫检测中的应用

诊断寄生虫学是动物疾病诊断领域的一门重要学科，是动物健康筛查不可或缺的组成部分。随着经典寄生虫学技术的发展，该学科在20世纪蓬勃发展，这些技术允许简单地检测寄生虫，例如康奈尔-威斯康星离心浮选技术。这些经过时间考验的技术的变体和修改仍然是许多诊断寄生虫学实验室的支柱。

虽然对粪便样本中的寄生虫生命阶段（例如卵、包囊、卵囊）进行形态学评估通常可以帮助识别分类水平（例如种、属、科），但经典的寄生虫学工具在明确识别某些寄生虫方面存在局限性物种。

分子技术可以提供急需的诊断解决方案，这对于有效的寄生虫病管理至关重要。许多血清学和分子检测，例如聚合酶链反应(PCR)，目前正用于特定的寄生虫检测。这些测试在研究/学术环境中更常见，但也可通过商业诊断实验室获得。

寄生虫检测的基本PCR方法

当形态学检测具有挑战性时，PCR越来越多地用于确认寄生虫种类（方框1）。有两种基本方法：物种特异性检测和一般检测。

Box1聚合酶链式反应概述

01,是什么？

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于选择性扩增（复制）两侧为已知序列的双链DNA的特定部分的过程。

02,它是如何工作的？

基本PCR包括3个步骤：

1。模板DNA两条链的变性

2.将引物退火到模板DNA的每条链上

3。引物延伸以合成新的DNA链

在变性步骤中，将模板DNA加热至94°C以分离互补链。接下来，降低温度（通常为50°C至65°C）以允许引物与模板DNA上的互补目标重组或退火。退火温度由两个引物的解链温度(Tm)决定。最后一步是延伸，在此期间DNA聚合酶使用反应混合物（PCR缓冲液，MgCl2）。延伸温度由特定的耐热聚合酶决定，通常在72°C左右。使用热循环仪将反应混合物加热到特定温度，持续设定时间和设定循环次数（35至45个循环）。亲本DNA模板呈指数级扩增，因此在35个PCR循环结束时，单个模板DNA可扩增350亿倍。

物种特异性PCR检测

物种特异性检测可以独家检测甚至来自近亲的寄生虫物种。对于这些测试，之前的研究已经确定了感兴趣的寄生虫物种（比如X物种）特有的DNA区域。然后设计特异性引物以精确扩增该区域。使用这种方法，仅通过PCR扩增就可以确认寄生虫是X种，不需要对PCR产物进行进一步测序。这反过来又减少了这些检测的周转时间（通常在同一天内）。通用PCR检测

通用检测通常会放大DNA的“可变区域”（每个寄生虫独有），两侧是“保守区域”（所有相关物种共有）。基于保守DNA区域的通用引物允许扩增来自所有相关物种的可变区域。扩增的PCR产物进一步测序，并根据公开可用的数据库进行搜索，以确定寄生虫的身份。这种方法可以在单次PCR运行中识别感兴趣的寄生虫或其他密切相关的物种。

与物种特异性分析相比，此方法的测序要求增加了通用分析的周转时间（2至5天）。通用检测中最著名的DNA区域（标记）是内部转录间隔子(ITS)、细胞色素c氧化酶(CO)和18S小亚基rRNA基因(18S)。

何时使用PCR

在诊断寄生虫学实验室中，PCR战略性地用于补充传统技术，主要是为了解决后者的诊断局限性。适当使用分子技术进行最终寄生虫检测取决于区分形态相似物种的需要。

例如在猫粪样本的硫酸锌粪便浮选试验中观察到的9-13×7-9um囊肿（图1），从形态学上可以鉴定为贾第鞭毛虫属。由于难以区分的贾第鞭毛虫包囊，无法进一步鉴定A到G的物种或组合。猫可能感染十二指肠贾第鞭毛虫组合F和/或组合A，这是一种人畜共患疾病。1基于为β-贾第鞭毛虫基因座可变区侧翼的2个保守区域设计的引物的PCR检测（即通用检测）通常用于区分贾第鞭毛虫组合。

图。1

图。2

相比之下，犬复孔虫（跳蚤绦虫；图2）的卵囊形态不同，只有一种复孔虫感染狗。因此，通过对狗的粪便样本进行显微镜检查来鉴定这种卵囊应该可以确认是否感染了犬吸虫，而无需进一步的分子分析/确认。

何时使用物种特异性PCR检测

物种特异性PCR通常用于排除或排除目标寄生虫物种，尤其是在需要更快的周转时间时。例如，对感染了绦虫的狗进行物种特异性PCR以确定是否存在多房棘球蚴（一种人畜共患物种）。Emultilocularis的卵（图3）在形态上与Taeniaceae科的其他成员没有区别；因此，这些虫卵的形态学诊断可以将寄生虫鉴定为绦虫科，而不是属或种。然而，有关业主希望诊断实验室能够快速识别该物种。基于NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢）脱氢酶亚基1基因(ND1)中独特核苷酸区域的物种特异性PCR测定已显示具有100%的检测特异性。

图3

使用特异性PCR的其他示例包括识别狗血样本中的恶丝虫（心丝虫）和猫粪便中的弓形虫。针对DimmitisCO1基因区域的物种特异性PCR检测无需专业知识即可从视觉上区分心丝虫微丝蚴与其他寄生虫。类似地，猫粪便中脱落的人畜共患原生动物弓形虫卵囊（图4）与鲜为人知的猫原生动物寄生虫弓形虫卵囊相似。基于独特的529碱基对重复元素的特定PCR测定用于明确检测弓形虫。

图4

物种特异性PCR的缺点是它无法检测到感兴趣的寄生虫感染。尽管有此限制，诊断实验室更喜欢物种特异性PCR以满足特定要求。

何时使用通用PCR测试

如果目标是更全面的寄生虫检测而不是快速周转，则通用测试可以派上用场。在上述多房绦虫的情况下，如果所有者对检测多房绦虫科物种的诊断优势有信心，则可以进行基于CO1基因的绦虫通用检测。该测定是从CO1的进化保守区域设计的，该区域位于一个可变区域的两侧，该可变区域提供区分棘球蚴属（包括细粒棘球蚴和加拿大桉树）和绦虫的所有成员所需的分辨率。同样，通用PCR（基于18S基因）用于鉴定犬血样中的犬巴贝斯虫和巴贝斯虫。血涂片无法区分这两种大型巴贝斯虫，通用PCR检测更具决定性。

寄生虫学研究

尽管缺乏许多具有兽医重要性的寄生虫的完整DNA序列信息，但通用PCR方法已经为常见寄生虫生成了急需的DNA标记信息，这些信息可通过从序列数据库中公开访问获得。这反过来又促进了通用PCR作为诊断寄生虫学研究的主要工具的使用。

通常，寄生虫学家使用经典技术将寄生虫鉴定缩小到尽可能低的分类水平，并在需要时使用通用PCR进行物种特异性鉴定。例如，5到6微米的卵囊（图5）属于隐孢子虫属。然而，该属有超过26个有效物种，大多数卵囊在形态上无法区分。浮选试验和可用的隐孢子虫酶联免疫吸附测定(ELISA)均无助于物种鉴定。狗可能会感染犬梭状芽孢杆菌和/或细小梭状芽孢杆菌，这两者都具有人畜共患病的可能性。偶尔，来自其他隐孢子虫属物种的卵囊可能作为假寄生虫通过狗的肠道。如果无法确定物种，就无法解决隐孢子虫向狗主人/饲养者传播的真正问题。在这种情况下，基于18S基因座的通用PCR检测可以提供必要的分辨率来区分每个隐孢子虫物种。

图5

假寄生虫

PCR已被有效地用于解决与伴侣动物相关的寄生虫诊断挑战，例如识别狗的假寄生虫；寄生虫的合适宿主。狗因吃其他动物的粪便而臭名昭著。

未能识别假寄生虫可能会导致不必要的治疗。例如，在狗粪便中观察到大约60×40um类圆线虫类卵（图6）通常被解释为犬嗜血杆菌感染。事实上，如果狗吃猫粪并将钩虫作为假寄生虫传播，就不可能在微观上区分物种。从这些卵中提取的DNA经通用PCR扩增和测序ITS-1标记将确定寄生虫身份。同样，使用ITS-2PCR将确定假类圆线虫类型的卵是反刍动物还是马科动物。

图6A

图6B

PCR检测的其他应用

PCR也可用于识别/确认从粪便中排出或从宿主身上移除的大体寄生虫标本。例如，从狗的眼前房取出的蠕虫通常被怀疑是吸食线虫、心丝虫或盘尾丝虫病。如果样品不适合形态学，则使用基于NADH脱氢酶亚基5基因(ND5)的通用PCR测定可能有助于在单次PCR运行中识别这些物种中的任何一种。

尸检时收集的样本也可以使用PCR进行检测。在这些情况下，病理学家经常寻求分子辅助来鉴定组织切片中的寄生虫，通常是为了确认肉孢子虫属、弓形虫属、新孢子虫属和哈蒙德属等属中的原生动物种类，它们的组织阶段很难区分。如果通过组织学获得关于更广泛的寄生虫分类学的线索，则PCR可用于识别许多常见的寄生虫（包括蠕虫和节肢动物）。

PCR检测的样品制备

寄生虫检测PCR的成功取决于多种因素，其中最重要的是用于初始DNA提取的样品。使用福尔马林等固定剂会损害DNA链的解离，而这是PCR扩增的必要步骤。因此，对于PCR检测，提交粪便样本作为新鲜/冷藏和大体寄生虫在70%乙醇防腐剂中至关重要。福尔马林固定的寄生虫标本，包括石蜡包埋的组织体积，需要特殊的DNA提取方案，这可能会限制成功PCR所需的DNA质量。

PCR的局限性

分子寄生虫检测目前不被认为是经典检测的替代方法。虽然在少数情况下用于诊断狗的先天性感染，但它主要用作通过寄生虫阶段的DNA检测未发生的寄生虫感染的确认测试。采用分子寄生虫学诊断的障碍很多。分子检测作为寄生虫检测的唯一诊断工具的发展需要繁琐的验证过程，这超出了许多诊断寄生虫学实验室的范围和范围。更重要的是，过度诊断的风险迫在眉睫。例如，一项研究在没有活动性肠道感染的猫的粪便中发现了弓形虫的PCR证据；感染寄生虫“-zoite”阶段的猎物作为DNA来源存在。必须谨慎解释此类结果。

结论

许多临床医生没有使用先进的诊断方法来检测细菌或病毒的病因，而是认为寄生虫的分子检测是辅助的和不必要的。任何新的、先进的寄生虫学测试，即使是那些旨在快速诊断的测试，都需要成本合理且具有临床相关性。因此，谨慎地利用分子进展来增强经典识别方法，以有效满足临床医生的诊断需求。