李毓龙团队利用新型GRAB探针解析组胺在大脑中的动态变化

点评 | 黄志力（复旦大学）、胡志安（陆军军医大学）、朱景宁（南京大学）

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“阿嚏！”又是一年花粉季，很多小伙伴会面临花粉过敏的困扰。服用抗过敏药之后，过敏症状得到缓解，但却会感到昏昏欲睡。这是为什么呢？原来抗过敏药物中含有抗组胺成分。当抗组胺药通过血脑屏障进入大脑，阻断中枢组胺受体，就会引起嗜睡。那么，组胺是什么？阻断中枢的组胺受体又为何会引起嗜睡呢？

组胺（Histamine，HA）是一种重要的单胺类信号分子，存在于中枢神经系统和外周组织，广泛参与免疫、消化和神经信号的调控。抗组胺药物常被用来缓解过敏反应，但是抗组胺药物的一大副作用是嗜睡，这引起科学家关注组胺在中枢系统中的功能。在大脑中，组胺能神经元的胞体主要分布于下丘脑结节乳头体核（Tuberomammillary nucleus, TMN），其神经纤维向全脑广泛投射。组胺能信号参与调节睡眠觉醒、学习记忆和摄食等重要生理学过程，但其分子调控机制尚不清楚。因此，为了揭示组胺对睡眠觉醒等生理学过程的分子调控机理，我们急需发展灵敏、特异，可对组胺进行高时空分辨率监测的有效工具。

2023年3月15日，北京大学李毓龙实验室在Neuron杂志在线发表了题为Genetically encoded sensors for measuring histamine release both in vitro and in vivo的研究论文，报道了新型基因编码的组胺探针GRABHA的开发，以及结合新工具对睡眠觉醒过程中的组胺动态调控的研究。

在这项工作中，李毓龙实验室首先灵活运用GRAB策略（GPCR-ActivationBased Sensor）将循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP嫁接到四种人源组胺GPCR受体的第三个胞内环，发现基于H4R的探针表现出优于其他受体的细胞膜定位特性，后续通过一系列优化，获得了基于H4R的组胺荧光探针GRABHA1h（简称HA1h）。在HEK293T细胞表达的HA1h探针对组胺有~370%的荧光信号响应（ΔF/F0）和~17 nM的亲和力（EC50）（图1）。为了进一步拓展探针对组胺浓度的检测范围，作者筛选了来自于不同物种的组胺受体，并开发了基于水熊虫H1R的组胺荧光探针GRABHA1m（简称HA1m），HA1m探针对组胺的最大ΔF/F0 ~590%，EC50 ~380 nM。HA1h和HA1m探针能在亚秒级（~0.3-0.6 s）时间尺度上响应胞外组胺浓度变化，且不与GPCR下游胞内信号偶联；进一步研究发现HA1h和HA1m探针只会响应组胺，而对组胺的前体、组胺代谢产物和其它神经递质均不响应，并且组胺引发的信号能够被相应受体的拮抗剂阻断，这说明探针保留了相应受体的药理学特性。

图1：新型组胺探针的刻画。A, 组胺探针工作原理。B, 组胺探针HA1h、HA1m和HA1mut在HEK293T细胞上的表达及对组胺的反应。C, 组胺探针对饱和浓度组胺的响应曲线。D, 组胺探针HA1h和HA1m对不同浓度组胺的信号响应。

组胺探针是否能够检测内源组胺的释放？作者借助AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的前额叶皮层（Prefrontal cortex, PFC），制备急性脑切片后使用双光子成像成功地记录到了电刺激引起的组胺秒级释放。此外，作者还实时地观察到组胺信号从刺激位置向外的扩散。因此，HA1m组胺探针可以实现对内源组胺释放的高时空分辨率检测。

组胺探针是否能够应用于活体动物中？组胺是调控睡眠觉醒的重要分子，视前区（Preoptic area, POA）是参与睡眠觉醒调控重要的脑区，且接收组胺能神经元密集的投射。作者首先利用AAV病毒将HA1m探针表达在小鼠的视前区，通过光纤记录探针的荧光信号，同时记录小鼠脑电和肌电以判断睡眠状态。作者发现在小鼠快速眼动（REM）睡眠向觉醒转换和非快速眼动（NREM）睡眠向觉醒转换过程中组胺信号升高，在觉醒向NREM睡眠转换和NREM睡眠向REM睡眠转换过程中组胺信号下降。作为对照，利用突变失活型探针观察不到明显的信号变化，说明信号检测的特异性。进一步的，作者在组胺合成酶敲除（HDC KO）的小鼠中发现HA1m探针信号也没有明显变化。综上所述，HA1m探针能够实现在活体小鼠中对组胺动态变化进行可靠、实时、特异的检测。

图2：不同核团组胺动态变化动力学在睡眠时相转换过程中存在差异。A, 探针表达和记录示意图。B, HA1h探针在PFC和POA的动态变化曲线。

组胺神经元胞体位于下丘脑结节乳头体核，并向全脑发出广泛投射。那么，组胺在不同脑区的动态变化模式是否一致？作者将HA1h探针表达在小鼠的视前区和前额叶皮层，同时记录了这两个脑区的组胺在睡眠觉醒中的动态变化（图2）。结果发现，两个脑区组胺探针信号大小在相同睡眠时相时是一致的。有趣的是，在REM睡眠向觉醒转换、NREM睡眠向觉醒转换和觉醒向NREM睡眠转换过程中，视前区的组胺变化动力学比前额叶皮层更快，这提示了组胺在不同脑区中存在不同的调控模式。总之，利用新开发的组胺探针，作者发现不同脑区的组胺动力学存在差异，为研究组胺的功能提供了重要的启示。

在中枢神经系统中，除了本项工作研究的睡眠觉醒调控外，组胺还参与其它的生理和病理过程，包括摄食、运动、认知、癫痫和偏头痛等。在外周系统中，组胺还参与过敏反应、瘙痒和胃酸分泌等过程。新型的组胺荧光探针将会成为研究组胺参与的功能和其调控机制的有力工具。

图形摘要：组胺荧光探针GRABHA的工作原理及离体和在体应用。

北京大学生命科学学院博士后董辉和博士生李梦尧（已毕业）为本文共同第一作者，李毓龙教授为通讯作者，实验室成员鄢羽岐、钱统瑞、林云致、刘灿、李国川和王欢对文章做出了重要贡献。该工作得到了阿姆斯特丹自由大学（Vrije Universiteit Amsterdam） Rob Leurs教授及其团队Xiaoyuan Ma和Henry F. Vischer的通力合作，以及浙江中医药大学/浙江大学陈忠教授团队和复旦大学中山医院杨向东教授团队的大力支持。

更多李毓龙实验室工作详见：http://yulonglilab.org/。此外，李毓龙实验室诚聘不同学科背景的副研究员、博士后及技术员，待遇从优。欢迎对脑科学感兴趣的有志青年加入！

专家点评

黄志力（复旦大学教授，中国睡眠研究会理事长）

第一代组胺H1受体阻断药易通过血脑屏障，最常见的副作用是嗜睡。但组胺H3受体拮抗剂负反馈增加组胺等觉醒相关递质的释放，已经被批准用来治疗嗜睡症。遗传学和药理学等证据表明中枢神经递质组胺具有促觉醒作用，但是，组胺等觉醒递质在脑内的动态变化模式、释放模式有待理精细分析。早期微透析方法揭示这些觉醒递质在觉醒时水平高，睡眠时降低。但由于微透析方法时间分辨率低，我们很难窥见这些觉醒递质释放的细节和差异。

北京大学李毓龙团队通过GRAB策略开发了检测胞外组胺的新型荧光探针，该探针灵敏度高，特异性强。利用新型组胺探针，他们进一步在小鼠睡眠觉醒相关核团研究了组胺在大脑不同时相中的动态变化。有趣的是，在小鼠视前区和前额叶皮层组胺的动态变化动力学存在差异，提示组胺在不同的核团功能可能存在差异。文章报道了两种不同亲和力的组胺探针，为检测不同浓度下的组胺提供了更多选择。李毓龙团队开发的组胺探针为研究组胺生理、病理和药理学作用和机制提供了强大的工具。

李毓龙团队前期开发的一系列神经递质荧光探针，为我们深入了解大脑中不同睡眠觉醒相关递质和调质功能，破解大脑奥秘提供有力支撑。

专家点评

胡志安（陆军军医大学教授， 陆军军医大学脑与智能研究院执行院长）

1910年，英国科学家Dale及其同事报道了一种能够刺激平滑肌收缩的物质，并命名为组胺。早期，组胺被认为主要参与炎性反应，抗组胺药物也主要用于治疗过敏性疾病。然而，在临床应用中,抗组胺药常被报道引起嗜睡等中枢神经系相关的不良反应。基于此线索，科学家发现脑内下丘脑结节乳头核（TMN）存在一群组胺能神经元，这些神经元在觉醒维持中扮演了重要角色。实际上，组胺的促觉醒作用具体体现为促进记忆、运动等脑的功能。我们实验室长期关注组胺对记忆的调控。既往一系列工作发现组胺通过提高内嗅皮层谷氨酸能神经元兴奋性，进而促进空间记忆获得（Chao et al., Cerebral Cortex, 2016；Chen et al., Cerebral Cortex, 2018）。

组胺在觉醒睡眠周期动态变化规律如何？不同组胺水平如何调控不同脑功能活动？既往的研究手段主要为在体场电位记录、钙成像等，通过监测组胺能神经元胞体功能活动间接反应组胺释放水平。限于技术手段，难于弄清不同功能靶区内组胺的释放情况及其动态变化规律。北京大学李毓龙教授团队多年来致力于开发基于GPCR的新型神经递质荧光探针，利用这些新型探针已经实现在体动态检测多种神经递质，包括乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺等动态变化。在最新出版的Neuron上，该团队报告成功研发出新型组胺荧光探针。经过上千次的筛选和优化，开发了具有反应速度快、高亲和力、高特异性等特点的新型组胺荧光探针，成功实现在特定功能脑区内组胺的动态变化的检测。更有意思的是，利用组胺荧光探针，该团队发现视前区和前额叶皮层内组胺水平均是在觉醒期高于睡眠期。视前区和前额叶皮层内组胺水平变化呈现不同的动力学特性，睡眠转觉醒过程中视前区组胺上升较比前额叶皮层快。

毫无疑问，新型组胺探针的开发为研究组胺如何调控不同脑功能活动提供了一大利器，将极大拓展我们对组胺发挥作用的机制认识。不仅如此，该项研究发现不同功能脑区内组胺的释放具有不同的动力学特征，提示组胺神经元存在异质性，这可为后续进一步在单细胞水平解析组胺神经元结构功能提供重要线索。

需要继续关注的是，前额叶皮层等功能脑区除了接受组胺能纤维支配外，还接受大量其它觉醒神经系统（如去甲肾上腺素，乙酰胆碱等）的纤维支配，回答不同促觉醒递质如何释放并协同工作的问题，是阐明觉醒系统工作原理的重大挑战。我们期待李毓龙教授团队开发出能同时监测多种神经递质释放的技术，以期全面地窥探在不同脑功能状态下各种促觉醒的神经递质的释放规律。

专家点评

朱景宁（南京大学教授）

组胺自1910年被发现以来，长期被认为作为一种外周局部激素发挥作用，参与调控胃肠道平滑肌收缩和免疫炎症反应等。直至上世纪七十年代左右，组胺才在脑内被发现，并被确定为一种中枢神经递质或神经调质。有意思的是，中枢组胺能神经系统在各物种间高度保守，人脑中的组胺能神经元约有64000个，全部聚集于下丘脑结节乳头体核这一小小的核团，但它们发出的轴突几乎支配了全脑。因此，组胺被认为发挥了“全脑功能的调节者”的作用，广泛参与睡眠觉醒、摄食节律、运动控制、学习记忆和情绪奖赏等多种基本生理稳态和高级功能的调控。已有四种组胺受体亚型（H1R-H4R）被相继鉴定出来，它们均属于G蛋白偶联受体（GPCR）。值得注意的是，组胺受体家族是目前药物开发投入产出比最高的受体家族之一，组胺能药物已被广泛应用于过敏、消化系统溃疡以及前庭疾病的临床治疗。此外，研究表明中枢组胺能神经系统还与睡眠障碍、嗜睡-猝倒症、Tourette综合征、多发性硬化、帕金森病、癫痫和酒精成瘾等密切相关。因此，阐明中枢组胺在各类生理功能和病理变化中的动态活动模式，对于深入认识中枢组胺能神经系统的脑功能调节机制，以及开发新型组胺能药物具有重要意义。然而，高灵敏度且具备时空分辨率的组胺探查工具至今依然缺乏。

北京大学李毓龙教授领导的团队是开发可遗传编码的检测神经递质/调质的荧光探针的国际顶尖团队，其最新开发的基因编码的基于G蛋白偶联受体（GPCR）激活的组胺探针可实现离体脑片和自由活动小鼠脑中细胞外组胺动力学的高时空分辨率监测。他们发表在Neuron上的研究工作，首次报道了连续完整的睡眠-觉醒周期中组胺信号的动态活动规律，发现了关键睡眠-觉醒调控中枢——视前区（POA）中的组胺信号在快速眼动（REM）睡眠向觉醒转换，以及非快速眼动（NREM）睡眠向觉醒转换的过程中均显著升高，而在觉醒向NREM睡眠转换和NREM睡眠向REM睡眠转换的过程中显著下降。特别是，该团队对比分析了接受组胺能纤维密集投射，并在与觉醒状态密切相关的执行功能（如注意和抉择）中发挥关键调节作用的前额叶皮层（PFC）与POA中的组胺信号，惊喜地发现虽然这两个脑区的组胺信号在睡眠-觉醒周期中表现出相似的变化趋势，却在REM/NREM睡眠向觉醒转换，以及觉醒向NREM睡眠转换过程中表现出截然不同的动力学特性，这为未来深入解析睡眠-觉醒与执行功能间相互作用和协调整合的神经机制和编码模式打开了新思路。

可以预见，高时空分辨率组胺探针的成功研发和不断迭代将为精细刻画中枢组胺在不同生理和病理过程中的动态变化提供有力的新工具，使得在高时空分辨率维度下重新解析中枢组胺能神经系统的活动规律成为可能，从而为全面认识中枢乃至外周组胺新功能，理解相关疾病发生发展新机制，以及研发干预治疗新策略注入新的活力。

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.02.024