种业交流 || CRISPR/Cas9基因编辑技术及其在小麦抗病性改良中的应用

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CRISPR/Cas9基因编辑技术原理

基因组编辑技术通过使用序列特异性核酸酶（sequence-specific nucleases, SSN），在目标基因组序列中产生位点特异性双链断裂（site-specific double-strand breaks, DSB），然后利用内源性DSB修复机制在目标区域产生各种突变。三种类型的SSN用于在选定位点引入DSB，包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein）（Zhan et al. 2021）。随后，DSB主要通过两种途径修复，非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重组（homology-directed repair，HDR）（Li et al. 2021c）。在NHEJ中，两个断裂的末端被简单地重新连接，在目标位点产生插入和/或缺失。当DSB中存在同源供体序列时，可以使用HDR修复，并可进行基因修饰（Li et al. 2021c）。SSN诱导的DSBs大多数是通过NHEJ进行修复，少数是通过HDR修复。

CRISPR/Cas系统在细菌和古细菌中用来防御外来质粒或病毒DNA元件。根据Cas基因的种类和干扰复合物的性质，它们分为六种类型（Hille et al. 2018）。II型CRISPR/Cas系统具有三个成分，即成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9，负责切割的外来DNA。为了简化系统，可将双tracrRNA:crRNA设计为单向导RNA （single guide RNA, sgRNA），以引导Cas9在体外产生DSB。近来，Awan et al.（2022）开发了一种RNA介导的基因组编辑工具CRISPR/Cas9来进行靶向突变。CRISPR/Cas9包含两个主要成分：负责识别靶DNA的sgRNA和负责在预先设计的靶DNA位点生成DSB的Cas9内切酶。来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）是第一个被充分研究的RNA引导的核酸内切酶。它是一种多功能蛋白质，包含两个核酸酶结构域：HNH结构域和RuvC-like结构域（Li et al. 2021b）。这两个结构域分别切割DNA的一条链，产生平末端DSB，DSB触发DNA修复系统，从而产生靶向突变体。将CRISPR/Cas9应用于靶向突变的唯一条件为靶点处需存在PAM（protospacer-adjacent motif）。对于SpCas9来说，PAM序列为NGG，对于不同的靶位点，只需改变sgRNA中的引导序列即可用于靶位点编辑（Li et al. 2021b）。

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CRISPR/Cas9基因编辑技术在小麦性状改良中的应用

迄今为止，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在小麦中广泛应用，主要应用于提高小麦产量、品质和抗逆性。例如，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）在植物生长发育、病原菌防御和损伤应激等方面具有多种功能。敲除TaLOX2改变了小麦的籽粒大小和重量，提高了小麦的耐贮性（Shan et al. 2014; Zhang et al. 2016）。敲除RING型E3连接酶编码基因TaGW2增加了小麦籽粒的长度和宽度，从而提高了籽粒产量（Li et al. 2021c）。最近，在冬小麦品种郑麦7698和春小麦品种Bobwhite中利用CRISPR/Cas9对TaSBEIIa进行靶向诱变，获得了高直链淀粉小麦，为培育营养价值更高的小麦新品种提供了新途径（Li et al. 2021a）。此外，利用CRISPR/Cas9技术可改良小麦抗病性，例如通过编辑小麦TaMLO基因获得抗白粉病小麦材料（Wang et al. 2014）。

普通小麦是由A、B和D亚基因组组成的六倍体作物，同时突变位于多个基因组位点的多个基因具有挑战性。因此，开发一种高效的CRISPR/Cas9介导的多重基因组编辑策略来破译复杂性状并促进小麦改良具有重要意义。近来，利用多顺反子tRNA策略已成功地在中国优良小麦品种中建立了高效的CRISPR/Cas9多重基因组编辑系统。研究人员以控制穗发芽抗性、氮吸收利用、株型、支链淀粉合成和磷转运的6个基因作为靶基因，分别构建同时靶向2个、3个、4个和5个基因组合的多基因编辑载体，以黄淮麦区大面积种植的小麦品种郑麦7698为受体材料，实现15个基因组位点同时编辑，获得了2、3、4、5个基因编辑植株，最高编辑效率可达50%。进一步通过胚拯救和后代分离，成功获得了无转基因、多个优异等位基因聚合的小麦新种质（Luo et al. 2021）。小麦高效、通用多基因编辑体系的建立，将有助于促进小麦分子生物学研究和复杂性状形成的网络解析，定向创制小麦新种质，加速育种进程。

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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术提高小麦抗病性的策略与挑战

病原菌侵染会显著降低小麦产量和质量，培育具有广谱持久抗病品种是控制病害确保小麦生产安全的有效策略之一（Li et al. 2022a）。以CRISPR-Cas9为代表的基因组编辑技术为突变小麦感病基因改良抗病性提供了有力工具（Gao 2021）。感病基因根据其介导的感病机理的不同归为3类，促进病原菌的寄主识别和侵入的基因，编码免疫信号负调节因子的基因，满足病原菌代谢或结构需求并促进其在寄主体内增殖扩展的基因。感病基因的突变或缺失会限制病原菌侵染致病的能力（Garcia-Ruiz et al. 2021）。使用CRISPR-Cas9系统靶向敲除小麦中的感病基因TaWRKY19和TaPsIPK1赋予了小麦对条锈菌的广谱抗性（Wang et al. 2022b; Wang et al. 2022c）。值得关注的是，Tapsipk1突变体在田间试验中表现出对条锈菌的广谱抗性且不影响产量，表明Tapsipk1突变体将成为未来小麦抗性育种的宝贵遗传资源（Wang et al. 2022c）。利用TALEN系统靶向敲除小麦感病基因TaMLO和TaEDR1增强了小麦对白粉病的抗性（Wang et al. 2014; Zhang et al. 2017b）。有趣的是，由TALEN系统产生的小麦突变体Tamlo-R32赋予了强大的白粉病抗性而且没有产量损失（Li et al. 2022b）。这些研究表明通过基因编辑突变小麦感病基因可以有效改良小麦抗病性。

传统的基因组编辑需要植物遗传转化和再生，这阻碍了在像小麦一样遗传转化比较困难的植物中的应用（Li et al. 2022a）。最近报道发现小麦WUSCHEL家族再生相关基因TaWOX5的过表达可以克服农杆菌介导的小麦遗传转化对基因型的依赖并大大提高小麦转化效率（Wang et al. 2022a）。过表达小麦生长调节因子GRF4（GROWTH-REGULATING FACTOR 4）与辅因子GIF1（GRF-INTERACTING FACTOR 1）的融合蛋白提高了转基因小麦的再生效率（Debernardi et al. 2020）。这些新的小麦转化再生技术显著提高了通过基因组编辑技术突变小麦感病基因的效率。设计基于大麦条纹花叶病毒的sgRNA递送载体，并通过病毒感染Cas9转基因小麦植株，从而实现小麦可遗传基因组编辑。这种既方便又无需组织培养的基因组编辑方法为突变小麦感病基因进行抗病育种铺平了道路（Li et al. 2021d）。此外，通过编辑感病基因产生的抗病性状可以通过杂交引入优良小麦品种，而先进的基因组育种方法如标记辅助选择和标记辅助回交（marker-assisted backcrossing）可加快这一进程（Li et al. 2022a）。2022年1月24日，农业农村部发布农业用基因编辑植物安全评价指南（试行），自此研究专家可以通过基因编辑技术开发高产、优质、抗病性强的小麦品种。在中国获得转基因作物生物安全许可大约需要6年左右，新发布的指南规定获得基因编辑作物生物安全证书可缩短至2年左右。农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）发布将极大推进通过突变小麦感病基因培育小麦抗病品种的进程。尽管过去几十年在鉴定小麦感病基因方面取得了实质性进展，但要完全揭示小麦感病的分子机制并改造感病基因以获得小麦的广谱抗病，我们还有很长的路要走。

来源：一麦众承 郭军