来源：生物岛
编辑：硕博生活圈
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编者按
基于第三代测序(TGS)平台的单细胞RNA-seq技术的发展促进了生物学研究的发展。自2016年以来，已经开发了几种基于TGS平台的单细胞RNA-seq方法。由于精度和灵敏度较低，它们要么结合基于NGS平台的方法来降低错误率，要么牺牲通量来提高检测率。
2023年1月11日，北京大学汤富酬等团队合作在Cell Discovery（IF=38）在线发表题为 “High-throughput and high-sensitivity full-length single-cell RNA-seq analysis on third-generation sequencing platform” 的研究论文，该研究在第三代测序平台上进行了高通量、高灵敏度的全长单细胞RNA-seq分析。该研究开发了一种基于TGS平台的高通量、高灵敏度的全长单细胞RNAseq方法SCAN-seq2。该研究对来自9个细胞系的5472个细胞进行了SCAN-seq2。该研究显示了数据处理管道的详细流程图以及过滤、解复用和重复数据删除后读取的总体统计数据。
通过参考引导转录组组装，该研究鉴定了数千种新的全长RNA异构体。假基因转录本可以与相应的亲本基因的转录本区分开来，其中数百个表现出细胞类型特异性的表达模式。此外，该研究发现V(D)J重排事件可以准确地确定高多态性T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)基因(免疫球蛋白)。最后，该研究证实了剪接体抑制剂异银杏素(IGG)作用后HepG2和Hela细胞的保守性凋亡反应。SCAN-seq2被证明是单细胞全长转录组研究的一个有前途的新工具。
在SCAN-seq2中，每32个具有不同3 '条形码的单细胞的第一链cDNAs在逆转录后聚集在一起。通过在PCR引物中引入24-nt条形码，在PCR扩增过程中加入不同的5 '条形码。通过这种方法，该研究一次测序最多可以测序3072 (32 × 96)个单细胞。平均而言，当对960个细胞进行测序分析时，作者在每个细胞中检测到超过4000个基因和4500个组装良好的RNA异构体。每个24 bp条形码的序列错误数总体上小于3，远低于96个不同条形码的编辑距离(11个碱基)。
该研究还比较了通过SCAN-seq2和基于NGS的方法鉴定的同一文库的ERCC UMI。当编辑距离为1时，86%的SCAN-seq2 UMI可以分配给相应的NGS UMI，验证了SCAN-seq2 UMI的合理质量。这些结果表明，SCAN-seq2具有高通量和高灵敏度。
然后该研究评估了交叉污染的水平。经过严格的质量控制，所有来自Library 4CL的细胞的基本reads都被正确地与小鼠或人类参考转录组对齐，只有一个细胞(0.28%)被鉴定为污染，证实了SCAN-seq2的低交叉污染率。在所有5个文库中，UMI计数与实际ERCC浓度之间的Pearson相关系数均高于0.85。SCAN-seq2与Smart-seq3合并数据的全局基因表达相关性为0.83，验证了两种方法的一致性。此外，每对单个细胞之间的平均相关性达到0.95，与Smart-seq3一样高，表明SCAN-seq2具有很强的重现性。
9个不同细胞系的SCAN-seq2分析（图源自Cell Discovery ）
在数据集中，SCAN-seq2在所有3种人类免疫细胞系(GM12878, H9, K562)中检测到PTPRC (CD45)基因的高表达。但PTPRC的主要RNA异构体表达不同。GM12878细胞仅表达PTPRC-209亚型，该亚型被转译为CD45 RABC蛋白。K562细胞只表达PTPRC-201亚型，该亚型被翻译成CD45 RO蛋白。而PTPRC-201、PTPRC-203和PTPRC-209异构体在H9细胞中同时表达。CD45 RO、CD45 RBC、CD45 RABC在不同程度上调控了下游信号通路的发育。这些发现与之前的研究一致，进一步验证了SCAN seq2在单细胞分辨率上区分同一基因不同RNA亚型的准确性。
SCAN-seq2允许在一次测序运行中对数千个单细胞进行测序。值得注意的是，对于960个细胞的测序运行，单个细胞的成本降低到约3美元，比SCAN-seq便宜20倍（每个细胞约60美元）。此外，UMI的引入确保了转录本定量的准确性。使用正交Sanger测序验证了包括假基因，未注释转录本和DTU事件的生物学发现，证明了SCAN-seq2的可靠性。
与其他已发表的基于TGS平台的scRNA-seq方法相比，SCAN-seq2同时表现出高通量和高灵敏度。作为一种全长测序方法，SCAN-seq2可以获得更均匀的转录本信息，而不会发生片段和富集。因此，为了获得全长转录本每个片段的相同覆盖率，SCAN-seq2所需的测序深度可能远低于短读长测序。作为一种更方便的工具，SCAN-seq2可用于以单细胞和单个RNA亚型分辨率研究不同的生物系统，并帮助了解许多疾病的复杂机制。
https://www.nature.com/articles/s41421-022-00500-4
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