JACS：光稳定性NIR-II荧光小分子突破血脑屏障实现无创脑成像

导读

近日，美国莱斯大学肖汉教授与上海药物研究所程震教授在光稳定性NIR-II荧光小分子的设计合成与脑成像应用方面取得新进展，相关研究成果以“Photostable Small-Molecule NIR-II Fluorescent Scaffolds that Cross the Blood-Brain Barrier for Noninvasive Brain Imaging”为题发表在Journal of the American Chemical Society上。本文报道了一系列具有可调的光学性能、高光学稳定性、明亮发射和生物稳定性好的（BF2）formazanate NIR-II染料。通过调控（BF2） formazanate染料中的苯胺取代基，可以显著改变分子穿透血脑屏障（BBB）的能力。此外，该系列NIR-II发射化合物还可以实现完整的脑成像并能动态记录染料分子穿透BBB的过程。在恶性胶质瘤（GBM）模型小鼠中，染料还能够区分正常和肿瘤脑组织。这种新型NIR-II荧光小分子将会在脑疾病治疗方面发挥重要作用，并为探针和药物的设计带来启发。文章链接DOI: 10.1021/jacs.2c11223。

正文

荧光成像技术具有高时空分辨率、无损显现和灵敏度高等特点，被广泛应用于生物医学成像等领域。与可见光区（400-700 nm）相比，近红外第二窗口（NIR-II，1000-1700 nm）具有更弱的组织吸收和自发荧光，因此更有利于提高成像的穿透深度。此外，相比于纳米材料探针来讲，NIR-II荧光小分子具有结构易裁剪、发射波长可调、光物理性质可控、低毒性和代谢速度快等优势。其中，NIR-II荧光小分子吲哚菁绿（ICG）在1956年就被美国食品监督管理局（FDA）批准应用于临床诊断和手术造影当中。除了ICG，包括聚次甲基类，苯并噻二唑类和二吡咯甲基二氟化硼类也都被报道用于NIR-II 成像当中(Scheme 1a)。尽管NIR-II荧光小分子的发展已经取得了巨大的进步，但是仍面临着BBB穿透性差的不足。

Scheme1.NIR-II荧光小分子骨架（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

本文中，作者通过调控（BF2）formazanate染料中的苯胺取代基，得到了一系列具有相对分子质量小、油水分配系数适宜（logP = 1~3）和低极性表面的NIR-II荧光小分子（Scheme 1b）。在（BF2）formazanate骨架上修饰不同的给电子基团，染料在胎牛血清（FBS）和DMSO溶液中表现出了NIR-II发射。实验数据表明所合成的染料具有超高的光学稳定性、大斯托克斯位移和明亮发射。体内和体外实验也证明了该系列染料可以有效地穿透BBB从而进行无损的NIR-II脑成像。此外，染料还能够区分正常脑组织和GBM组织，从而进行特异性地成像检测。

Figure1.BF1-BF8染料的化学结构及在不同有机溶剂和生物基质中的光物理表征。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

（BF2）formazanate荧光团由于高度离域的π-体系和低阶前线轨道而具有丰富的光物理性质。实验中，作者合成了一系列NIR-II小分子（Figure 1a）。理论计算也表明HOMO和LUMO的电子云主要分布在BF2骨架上，其余分布在N的1,3-号位上的π-共轭芳香环（Figure 1b）。接下来，作者测试了（BF2）formazanate染料在有机溶剂和生物基质中的光物理性质。BF1-BF8在DMSO中的NIR吸收峰在727-859 nm范围内。随着取代基的不同，染料在DMSO中的吸收峰也逐渐红移（Figure 1c），DMSO和FBS溶液中染料的发射波长范围在800-1400 nm（Figure 1d）。如Figure 1e所示，采用不同的长通滤光片对染料发光进行过滤后，BF1-BF8仍能保持荧光波长 >1000 nm的明亮发射。值得一提的是，BF1染料在DMSO和FBS溶液中分别表现出230 nm和198 nm的Stokes位移（Figure 1f）。此外，BF1在FBS溶液中还能保持较高亮度的NIR-II发射（Figure 1g）。在光稳定性实验中，BF1在长时间高强度的激光照射下仍能保持良好的发射行为，性能要优于ICG染料（Figure 1h）。此外，BF1在高pH和活性氧成分的存在条件下，仍可以展现出良好的化学稳定性（Figure 1i）。

Figure2.BF1-BF8染色U-87 MG细胞的荧光成像及体外穿透血脑屏障模型测试。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接下来，作者将U-87MG细胞分别与BF1-BF8染料进行共培养。细胞图像表明所有的染料都具有良好的细胞膜穿透性和明亮的NIR-II发光（Figure 2a）。作者还进行了细胞内染料光稳定性的测试，实验结果表明相比于ICG，BF1具有更好的光学稳定性（Figure 2b,c）。为了测试（BF2）formazanate染料的BBB渗透性，作者还制备了体外实验模型（Figure 2d），数据表明BF1和BF6具有较高的BBB渗透率（Figure 2e）。BF1和BF6的体外模拟组织穿透性测试也证明在5 mm的深度下也依然能够观察到两种染料的荧光信号（Figure 2f-i）。

Figure3.BF1-BF8染料对小鼠脑血管和组织的NIR-II成像。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

鉴于（BF2）formazanate染料的优越的光学性质，作者考察了BF1和BF6的活体成像性能。如Figure 3a,c所示，采用尾静脉注射小鼠活体后，在脑组织中依然能够看到BF1和BF6的发光信号，成像信噪比高达2.5-2.9（Figure 3b,d）。对比之下，注射ICG之后，仅能在主要的脑血管中观察到其荧光信号。随着时间的延长，信号则逐渐消失（Figure 3e,f）。此外，在活体注射2 h后，BF1和BF6主要在脑组织中积累，表现出强烈的荧光信号（Figure 3g,h）。为了进一步证实BF1和BF6的BBB穿透性，作者还分别对所提取脑组织中的染料分子进行了质谱和高效液相色谱的表征（Figure 3i-k）,再次证明了BF1和BF6具有高BBB通透性。作者选用具有较高成像信噪比的BF6作为研究对象并对其穿透BBB的过程进行了动态监测。相比于ICG来讲，BF6的动态扩散速率更快，更易于穿透BBB（Figure 3l-p）。

Figure4.患有原发性胶质瘤的小鼠模型在尾静脉注射BF1/BF6和ICG后不同时间段的白光和NIR-II图像测试。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者分别将BF1、BF6和ICG注射到患有GBM的模型小鼠体内，可以看到BF1和BF6在脑组织中表现出明显的荧光信号（Figure 4a-d）,证明了两种染料可以达到优异的活体成像效果。

总结

美国莱斯大学肖汉教授与上海药物研究所程震教授报道了一系列具有高光学稳定性、较强的生物稳定性、大Stokes位移、明亮的荧光发射和良好的BBB穿透能力的NIR-II染料。相比于之前报道过的NIR-II荧光小分子骨架，在（BF2）formazanate染料中修饰吗啉基团后，分子可以有效穿透BBB并能够穿透小鼠完整的皮肤组织和颅骨进行活体NIR-II脑成像。在GBM模型小鼠中，该染料还能够区分正常和肿瘤脑组织。这项工作介绍了一系列具有小尺寸、良好的亲脂性、低极性表面、光物理性能可调的新型NIR-II荧光团，为脑成像治疗探针的设计提供了行之有效的分子骨架。

文献详情：

Shichao Wang, Hui Shi, Lushun Wang, Axel Loredo, Sergei M. Bachilo, William Wu, Zeru Tian, Yuda Chen, R. Bruce Weisman, Xuanjun Zhang, Zhen Cheng,* Han Xiao*. Photostable Small-Molecule NIR-II Fluorescent Scaffolds that Cross the Blood-Brain Barrier for Noninvasive Brain Imaging. J. Am. Chem. Soc. 2022, https://doi.org/10.1021/jacs.2c11223