施一公团队 2023 首秀！发现 APOE4 受体，揭示阿尔兹海默症潜在致病因子

导读

APOE 的基因产物 APOE 在脂质代谢、免疫调节和神经学中起着关键作用。最常见的三种 APOE 等位基因对应于三种蛋白质异构体，分别是 APOE2、APOE3 和 APOE4，它们仅在 112 和 158 两个氨基酸位置上存在差异。尽管只存在微小差别，但前期的研究数据表明，这些 APOE 亚型在生理和病理学层面却表现出不同的作用。

其中，APOE 的免疫调节作用最初是作为血浆脂蛋白对 T 细胞增殖抑制作用的一部分被发现的。研究表明，APOE 能够抑制 T 细胞增殖和中性粒细胞激活，并且可以调节巨噬细胞功能、促进脂质抗原呈递和调节炎症和氧化。

此外，APOE 亚型在神经学和神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）中也有明显的作用。例如，与最常见的 APOE3 亚型相比，APOE4 亚型发病年龄相对较早，显著增加 AD 风险。相比之下，APOE2 则具有保护作用。目前，越来越多的证据表明，免疫系统功能障碍在 AD 病理中起着关键作用，特别是小胶质细胞的异常激活，而 APOE4 的过表达同样可以激活小胶质细胞。但是，APOE4 发挥作用的潜在机制却仍不明确。

2023 年 1 月 2 日，西湖大学施一公团队在Cell Research在线发表题为 LilrB3 is a putative cell surface receptor of APOE4 的文章，该研究发现，白细胞免疫球蛋白样受体 B3（LilrB3）是 APOE4 的潜在细胞表面受体，两者可特异性结合，并阐明了这种特异性配体-受体识别的结构基础。同时，他们的研究发现，LilrB3 与 APOE4 结合还会触发小胶质细胞的激活。这些实验结果为 APOE 亚型依赖的功能和疾病研究提供了线索。

图片来源：Cell Research

主要研究内容

APOE4 与 LilrB3 特异性相互作用

首先，研究人员通过一系列实验证实APOE4 可与 LilrB3-胞外结构域（ECD）表现出强烈的相互作用，但与任何同家族内其他 LilrB-ECD 则没有相互作用。虽然 APOE3 也与 LilrB3-ECD 相互作用，但结合较弱。

为了进一步描述这种相互作用，他们将不断增加的 LilrB3-ECD 浓度滴定到固定量的 APOE2/3/4 中。与 APOE3 相比，LilrB3-ECD 与 APOE4 的结合更紧密，与 APOE2 的结合则检测不到。此外，他们还量化了 APOE2/3/4 与 LilrB3-ECD 之间的相互作用。与上述结果一致，APOE4 与 APOE3 相比，与 LilrB3-ECD 结合更紧密；而 APOE2 则无法与 LilrB3-ECD 结合。

图片来源：Cell Research

APOE4 在细胞表面被 LilrB3 特异性识别

接下来，他们研究了 APOE4 是否能在细胞表面被 LilrB3 特异性识别。研究人员在 HEK293F 细胞中表达 RFP 标记的 APOE4 后，收集含有 APOE 的上清液，分别与 6 种不同的 HEK293F 培养物孵育，每种培养物都表达特定的 GFP 标记的 LilrB 受体。实验结果表明APOE4 与细胞表面的 LilrB3 之间存在浓度依赖的相互作用，并且 APOE4 特异性地与细胞表面的 LilrB3 结合，而不与任何其他 LilrB 受体结合。

为了确认上述结果，他们还使用共聚焦显微镜进行了观察。正如预期的那样，APOE4 仅在表达 LilrB3 的细胞表面大量存在，并且 APOE4 的细胞表面定位与 LilrB3 的定位一致。

图片来源：Cell Research

LilrB3 识别 APOE4 的结构基础

为了了解 LilrB3 识别 APOE4 的结构基础，研究人员纯化了 APOE4-N 端结构域 (NTD) 和 LilrB3-ECD 之间的二元复合物，并对样品进行冷冻电镜 (cryo-EM) 分析。在结构分析中发现，两个 APOE4-NTD 分子与两个 LilrB3-ECD 分子结合。每个 APOE4-NTD 与 LilrB3-ECD 的两个副本结合，与一个 LilrB3 分子的 D2 和另一个分子的 D4 结合。值得注意的是，两个 APOE4-NTD 分子之间没有直接接触。他们推测，这种结合模式可能有利于细胞内信号传递。

图片来源：Cell Research

APOE4 以 LilrB3 依赖的方式激活小胶质细胞

在上述体外结合实验中，LilrB3-ECD 特异性识别 APOE4，但不识别 APOE2，并且 APOE4 优先与细胞表面的 LilrB3 受体结合，而不是其他 LilrB 受体。为了检测这种相互作用的潜在后果，研究人员在人类小胶质细胞 3 (HMC3) 细胞系中敲除了 LilrB3 基因并评估了 APOE 亚型处理对 WT 和 LilrB3-null HMC3 细胞的影响。

随后，他们从这些细胞中提取总 RNA 并进行转录组测序分析。经过生物信息学分析，他们在 APOE4 处理的 WT HMC3 细胞中鉴定出 167 个差异表达基因，其中 95 个基因上调，72 个基因下调；相比之下，对于 APOE3 和 APOE2 处理组，上调和下调的基因数量分别为 76/9 和 34/1。这些数字表明，与 APOE3 或 APOE2 相比，APOE4 诱导的变化更为明显。后续的主成分分析也显示 HMC3 细胞对三种 APOE 亚型的处理存在不同的反应。

进一步的分析发现，大部分 APOE4 刺激的基因参与了促炎反应，包括干扰素、细胞因子和抗病毒信号通路。特别是 30 个 I 型干扰素刺激基因 (ISGs)，其中包括抑制病毒进入的 IFITM3。这些具有代表性的 APOE4 响应基因也通过实时定量 PCR 得到了验证。

最后，他们还评估了 APOE 亚型对 LilrB3 缺失 HMC3 细胞的影响。结果发现，与 WT HMC3 细胞相反，在 LilrB3- null 细胞中，响应 APOE4 处理的上调和下调基因的数量分别急剧减少到 18 个和 1 个。综上所述，这些实验数据表明，在没有 LilrB3 表达的情况下，APOE4 激活 HMC3 细胞的能力被严重破坏。

图片来源：Cell Research

结语

综上所述，在本研究中，他们鉴定出 LilrB3 可作为 APOE4 的特异性细胞表面受体，并详细解析了这种特异性配体-受体识别的结构基础。同时，他们的初步实验证据还表明，LilrB3 与 APOE4 结合可触发小胶质细胞的激活。因此，这些实验结果为将来进行更加深入的关于 APOE 亚型依赖的功能和疾病研究提供了基础，比如其在阿尔兹海默症中的作用以及发挥作用的分子机制。

题图来源：站酷海洛

参考文献：

1. J. Zhou et al. LilrB3 is a putative cell surface receptor of APOE4. Cell Research (2022) 0:1–15.

2. Chen, Y., Strickland, M. R., Soranno, A. & Holtzman, D. M. Apolipoprotein E: Structural Insights and Links to Alzheimer Disease Pathogenesis. Neuron 109, 205–221 (2021).

3. Roy, E. R. et al. Concerted type I interferon signaling in microglia and neural cells promotes memory impairment associated with amyloid beta plaques. Immunity 55, 879–894.e6 (2022).

题图来源：自制