南洋理工浦侃裔教授Nature Biomedical Engineering：具有超声诱导余辉发光的纳米颗粒用于肿瘤特异性治疗

光学成像可以在分子水平上密切监测生理病理过程，因此常规用于解读生物学和诊断疾病。为了最大限度地减少自发荧光并提高信号背景比(SBR)，余辉成像使用材料(如半导体聚合物和掺杂稀土的无机纳米材料)作为“光学电池”，将光能存储在缺陷中，然后在光照射停止后缓慢释放光子。与酶催化生物发光和放射性同位素切伦科夫成像相比，余辉成像具有近红外(NIR)发射可调、发光可再生和可重复以及长寿命等优点，这使得该成像模式可用于多种活体成像应用，如对转移性肿瘤的超灵敏检测、术中图像引导手术、前体药物激活的实时追踪和器官损伤的早期诊断。

基于此，新加坡南洋理工大学浦侃裔教授发现了产生超声诱导的余辉的有机纳米粒子，以及它们在癌症免疫诊疗中的概念验证应用。“声余辉”纳米粒子包含一种作为引发剂的声敏剂，以产生单线态氧，随后激活衬底以发射余辉发光，与之前报道的光余辉相比，在更大的组织深度(4 cm)时，这种发光更明亮，且可检测。我们制备了含有单线态氧裂解前体药物(用于免疫应答调节剂咪喹莫特)的声余辉纳米颗粒，该纳米颗粒在炎症生物标志物过氧亚硝酸盐(由肿瘤相关的M1样巨噬细胞过度产生)存在的情况下特异性启动。该纳米粒子的全身递送允许在声后发光引导下对小鼠皮下乳腺癌肿瘤进行治疗。分子超声后辉光成像的高灵敏度和深度为在体实时监测病理生理过程提供了优势。相关工作以“Nanoparticles with ultrasound-induced afterglow luminescence for tumour-specific theranostics”发表在《 Nature Biomedical Engineering》。

【文章要点】

图1. SNAPs的筛选与优化

SNAPs的发展

为了优化声余辉，研究者筛选了一系列在超声应用中产生 1O 2的声敏剂，包括虎红辛酯(RB)，血卟啉(HMP)，维替泊芬(VP)和2,3-萘菁双(三己基硅氧基)硅(NCBS)(图1a-b)。它们是具有可见到近红外发射的荧光剂。聚合物或小分子可以与 1O 2反应产生自发发光的二氧烷中间体，被筛选用于作为声后发光底物，包括苯氧基-金刚烷(PA)，叠氮-甲基丙烯酸酯-苯氧基-金刚烷(AMPA)，聚[2-甲氧基- 5-(2'-乙基己氧基)-1,4-苯基乙烯](MEHPPV)，DPAo和DPAs。在两亲性稳定剂聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)(PEG-b-PPG-b-PEG)存在的情况下，通过共纳米沉淀，将这些声后辉引发剂和底物的不同组合来制备SNAPs。通过动态光散射测量到SNAPs的水动力直径在50 ~ 120 nm之间，通过透射电子显微镜(TEM)检测到SNAPs的球形形态(图1f)。

图2. 声波余辉的深层组织诱导

亮声余辉的深层组织诱导

在超声(1.0 MHz)或激光(808 nm)照射相同时间(30 s)后，采集NCBS/ DPAs SNAP信号，比较声后辉光与光后辉光的差异。超声的功率强度为2.0 W cm −2，这是之前优化的功率强度，在1.0 ~ 3.0 W cm −2的皮肤安全范围内;然而，激光的最大允许曝光量(0.33 W cm −2)(图2a)。在此条件下，声余辉强度是光余辉的2.4倍，与激光照射90 s后的强度相等(图2b)。为了深入了解声后辉光比光后辉光更明亮，我们研究了超声或激光照射下NCBS产生的 1O 2超声作用下的O 2生成是激光照射相同时间(30 s)下的1.6倍(图2c和补充图10)，表明更高效的O 2生成是更强的声余辉信号的一个因素。在这些短时间照射条件下(超声照射30 s或激光照射90 s)， NCBS/ DPAs SNAP没有检测到细胞毒性(图2d)。这可能与纳米粒子内部的余辉衬底对 1O 2的清除作用有关。但在长期超声照射(5 min)后，NCBS/ DPAs SNAP诱导90%的癌细胞死亡，是相同时间激光照射的1.6倍。将不含NCBS的SNAP (SNAPc)与癌细胞共孵育，再进行超声辐照，研究其对细胞活力的空化作用。相同浓度的SNAP和SNAP分别引起19.8±3.9%和84.9±4.7%的4T1癌细胞死亡，表明空化对细胞活力的作用较小。此外，电子自旋共振(ESR)光谱显示，超声应用下SNAP产生的 1O 2是其他活性氧(包括·OH和O 2 ·−)的约216倍。这些结果证实了声敏剂在SNAP中的声动力学效应是肿瘤细胞杀伤的主要原因。总体而言，这种应用时间依赖的超声毒性使安全的声后辉光成像(短期，30 s)和声动力肿瘤杀伤(长期，5分钟)成为可能。

图3. M1巨噬细胞的可激活声余辉成像

生物标记物激活声余辉成像

促炎微环境状态在肿瘤的发生和进展中起关键作用，因此可作为癌症免疫治疗的预后标志。尽管分子成像在癌症诊断和治疗中具有重要意义，但现有的大多数显像剂都具有“始终开启”的信号，并通过被动累积产生非特异性信号。为了使信号与肿瘤微环境的促炎状态相关联，研究者基于NCBS/ DPA SNAP开发了一种可激活的分子超声余辉探针(将其命名为SNAP-M)(图3a-b)。过氧亚硝酸盐(ONOO -)被选为促炎肿瘤微环境的生物标志物，据报道与免疫治疗的阳性预后相关。ONOO -由肿瘤相关的M1样巨噬细胞(M1巨噬细胞)通过一氧化氮(NO, iNOS:诱导型一氧化氮合酶的产物)和超氧阴离子(O 2 ·−，线粒体电子转移链的产物)之间的反应过度产生，并广泛分布于肿瘤微环境27。ONOO -发挥直接的肿瘤杀伤作用，并促进其他免疫激活因子，从而抑制肿瘤血管生成和抑制转移龛形成，这使M1 -巨噬细胞具有与促肿瘤的M2巨噬细胞形成鲜明对比的抗肿瘤表型28。与NCBS/ DPA SNAP不同，SNAP-M由一个沉默的DPA与ONOO -响应部分(Pro-DPA)组成。因此，SNAP-M的声余光可以被促炎肿瘤微环境特异性激活。同时，利用"always-on" NCBS荧光追踪SNAP-M的位置。为了研究SNAP-M的检测选择性，我们在不同的活性氧和氮(RONS)和金属离子孵育后检测了声余辉(图3c-d)。与ONOO -孵育后，SNAP-M的声余辉增加了140倍，但对于其他的RONS，包括次氯酸盐(ClO -)，超氧阴离子(O 2 •-)，羟基自由基(•OH)，过氧化氢(H 2O 2)和一氧化氮(NO)，以及金属离子，包括钙离子(Ca 2+)和亚铁离子(Fe 2+)，仍然保持几乎不变。此外，SNAP-M的声余光与ONOO -浓度具有良好的线性关系，显示检测限(LOD)可降至0.3 μM。

图4. 声余辉癌症体外免疫治疗

通过声余辉的癌症免疫治疗

尽管免疫疗法在癌症治疗中很有前景，但不同类型的癌症，甚至在相同恶性肿瘤的队列中，患者的应答情况也不同，这导致治疗失败或过量相关毒性。随着缓解率和治疗结果与促炎肿瘤微环境密切相关，人们迫切希望能够对促炎肿瘤微环境发送实时反馈信息的癌症免疫治疗药物来指导治疗方案。为了实现这种精准的癌症免疫治疗，SCAN不仅包括沉默的声后光引发剂Pro-MB：一种与ONOO -可裂解部分结合的亚甲蓝(MB)衍生物，还包括M1极化前药Pro-R837：一种与a 1O 2 -可裂解部分结合的imiquimod (R837)衍生物(图4a-b)。只有在高水平ONOO存在的促炎肿瘤微环境中，声余辉启动器被激活，产生声动力学效应(产生 1O 2)，从而导致来自基质AMPA的声余辉进行反馈;此外，产生的 1O 2导致咪喹莫特从Pro-R837上裂解，用于原位激活免疫治疗。根据设计，由于MB呈笼状(图4c-d)，SCAN本质上可以忽略荧光、超声应用下的 1O 2生成和超声余光。加入ONOO后，SCAN的荧光增强了95.1倍， 1O 2生成增强了4.4倍，声余光增强了近80倍。然而，其他测试的RONS和金属离子未观察到显著变化。扫描的声后辉光强度与ONOO -浓度具有良好的相关性，LOD为0.1 μM，是荧光LOD的2倍。此外，未激活的SCAN在超声应用时不会导致4T1癌细胞死亡;相比之下，ONOO -激活的SCAN在超声应用5 min后导致78.1%的4T1癌细胞死亡(图4e)。这表明在ONOO -存在的情况下，SCAN有效的声动力杀伤肿瘤被特异性激活。

图5. 活体声余辉癌症治疗

为了证明SCAN在体内的精准免疫诊疗能力，研究者提出了诊疗方案，并在皮下4T1荷瘤小鼠中进行了测试(图5a-b)。以不使用Pro-R837的SCAN-C作为对照。首先，对患者进行全身扫描。在MB的近红外荧光(NIR)指示的SCAN的最佳肿瘤累积(第0.5天)，检测超声余光以评估肿瘤固有的M1特征促炎水平，随后长期超声应用(5分钟)诱导来自SCAN的 1O 2生成和Pro-R837激活，用于M1巨噬细胞极化的声免疫治疗(根据体外 1O 2生成和Pro-R837激活的动力学；图4c-f)。在第2天，由于扫描组件的消耗，声余辉信号下降到基线水平，提示需要多次扫描。因此，给予一个新的扫描剂量，并检测超声余辉，并与之前的扫描剂量进行比较。序列扫描成像的声后辉光强度的差异定义为ΔS，并用于与每次治疗后肿瘤M1特征的促炎状态的增加水平相关。重复这些步骤，形成一个诊疗周期，以便密切监测SCAN的免疫治疗结果。与第一剂(第0天)相比，第二剂后的声后辉光强度增加了4.82倍，而第三剂后的声后辉光强度增加了1.74倍(图5 e)。这表明三种剂量的SCAN可以改善肿瘤的促炎状态，这可能与增强的M1型巨噬细胞群有关。而ΔS在第4次给药后差异无统计学意义，提示SCAN可能不再改善促炎肿瘤微环境；因此，停止了这样的诊疗方案。因此，在第8天，SCAN+超声治疗诱导的声后辉光强度是SCAN-C+超声治疗组和SCAN组的1.8倍和3.3倍，这表明联合声动力免疫治疗(SCAN +超声)诱导了更高水平的M1型巨噬细胞极化。

【小结】

研究者报告了一个用于活体动物深层组织诱导和无背景光学成像的超声诱导后辉光纳米颗粒(SNAPs)库。凭借模块化的声余辉机制，SNAPs可发展为可激活的诊疗纳米探针，用于准确检测疾病微环境中的细微分子变化，并纵向监测治疗结果以指导干预。除了在体药物筛选和精准医疗的潜力外，声后辉光成像的组织深度可能为实时无创检测生理病理过程提供机会，灵敏度水平和组织深度是其他光学模式无法实现的。

https://www.nature.com/articles/s41551-022-00978-z

来源：高分子科学前沿

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