刘伟/Dante Neculai课题组发现脂滴自噬受体

脂滴（lipid droplets,LDs）是从内质网膜形成的一种独特的细胞内结构，不同于其他膜性细胞器，它们由单层磷脂层包裹，内部充满中性脂类。脂滴的数量和大小根据细胞种类差异显著，并且高度动态，随细胞的营养状态发生改变。作为细胞内储存脂质的细胞器，脂滴的合成和分解不仅与细胞的脂质代谢密切相关，还能通过脂质介质的产生和与内质网和线粒体等细胞器之间的直接相互作用，参与调控细胞能量和氧化还原稳态以及内质网和细胞膜的稳态。既往认为，脂滴的分解主要依赖脂滴上中性脂肪酶的脂解作用（lipolysis），逐步将脂滴内的甘油三酯降解为甘油和脂肪酸。2009年脂滴首次被发现能通过自噬降解，抑制自噬能显著增加肝细胞中脂滴的数量和大小，肝组织中甘油三酯水平显著升高。其后，这种依赖自噬-溶酶体的脂滴降解途径（lipophagy）在多种其他细胞中被证实。

细胞器选择性自噬（selective autophagy）发生的关键步骤是自噬膜对损伤或不需要的细胞器的特异性识别和包裹，这需要细胞器上存在特定蛋白质扮演受体的角色，通过与自噬膜上的LC3/GABARAP家族蛋白的相互作用，或是由p62等接头蛋白介导细胞器表面蛋白与LC3/GABARAP蛋白的结合。近年来，线粒体和内质网等膜性细胞器以及核糖体和蛋白聚集体等结构上多种自噬受体和接头蛋白的发现和鉴定，促进了我们对选择性发生机制和生理病理功能的认识。然而，虽然有研究发现某些脂滴结合蛋白在脂滴自噬中发挥作用，脂滴自噬的特异受体及其调控机制一直未被鉴定和明确。

2022年12月7日，浙江大学国际医学院/附属第四医院的刘伟课题组与Dante Neculai课题组合作，在Protein & Cell杂志在线发表题为ORP8 acts as a lipophagy receptor to mediate lipid droplet turnover的研究论文，发现脂质转运体蛋白ORP8能定位脂滴，并通过与LC3/GABARAPs的直接相互作用，招募自噬隔离膜对脂滴的包裹和经由溶酶体的降解。他们进一步发现，能量感受激酶AMPK能磷酸化ORP8，通过增强ORP8与LC3的结合，促进脂滴自噬。结合in vitro、in cell和基因敲除小鼠的种种证据表明，ORP8是一个介导脂滴自噬的受体蛋白（lipophagy receptor）。

作者首先从细胞中分离脂滴，通过与纯化的LC3B蛋白孵育，HPLC-串联质谱筛选到ORP8与LC3B的潜在结合，并通过细胞生化手段验证了两者的相互作用。然后，作者通过Ariyscan高分辨率显微成像、脂滴纯化和APEX标记电镜等手段确定ORP8能定位于脂滴和在诱导脂滴自噬条件下ORP8在脂滴定位的增加。通过构建不同的缺失突变体，作者进一步发现ORP8的跨膜结构域是决定其脂滴定位的关键结构域。接下来，作者发现敲低或敲除ORP8会导致细胞中脂滴含量增多、甘油三酯水平升高和脂滴标志蛋白PLIN2的增加；而过表达ORP8会减少脂滴和降低细胞甘油三酯水平。为了研究ORP8调控脂滴的机制，作者通过使用脂酰辅酶A合成酶抑制剂Triacsin抑制脂滴的合成和敲除脂解关键酶ATGL等方法，发现ORP8促进脂滴的降解不依赖于ATGL介导的脂解作用。通过比较过表达野生型ORP8或缺乏脂质转运能力的ORP8突变体，作者发现ORP8促进脂滴降解的功能不依赖其脂转运活性。

接下来，作者对ORP8是否介导脂滴自噬进行了研究。他们发现，ORP8促进脂滴降解依赖自噬蛋白ATG7；利用mCherry-GFP-livedrop探针检测细胞内脂滴自噬通量，并结合共聚焦显微成像与流式细胞术等多种手段发现，ORP8敲除细胞中脂滴自噬水平显著降低；此外，ORP8与自噬体和溶酶体发生明显的共定位；敲除ATG7或使用氯喹抑制自噬后，ORP8蛋白累积。这些观察结果提示ORP8直接参与脂滴自噬过程，并且其自身经自噬途径降解。有趣的是，通过检测LC3标记的自噬体数量以及自噬底物p62蛋白的水平，作者发现敲除ORP8并不影响饥饿诱导的细胞整体自噬水平。通过检测分离自野生型和ORP8敲除细胞中的脂滴上结合的LC3水平，和体外分析纯化的脂滴与自噬膜的结合，作者证明ORP8在招募自噬膜靶向脂滴的过程中发挥关键作用。进一步，作者通过GST-pull down与CO-IP等实验证明ORP8能够直接结合LC3/GABARAPs家族的多个蛋白，并且鉴定出ORP8蛋白上与LC3相互作用的关键位点。基于这些位点的突变体的制作和运用，进一步证明ORP8是介导脂滴自噬的受体蛋白。

已知AMPK参与脂滴自噬，作者因此研究了AMPK对ORP8介导的脂滴自噬的调控作用。他们发现诱导脂滴自噬条件能同时激活AMPK和导致ORP8的磷酸化，而抑制AMPK活性显著减弱ORP8的磷酸化水平。通过体外激酶实验结合蛋白质磷酸化修饰的质谱分析，作者发现ORP8是AMPK的磷酸化底物并鉴定了ORP8上的AMPK磷酸化位点。作者还发现AMPK对ORP8的磷酸化作用虽然不会增加ORP8在脂滴的定位，但能显著增强ORP8与LC3的结合, 从而促进脂滴自噬。最后，利用ob/ob肥胖小鼠，他们发现过表达ORP8能缓解小鼠肝脏中脂滴的累积和甘油三酯的升高；通过建立ORP8基因敲除小鼠，发现这些成年小鼠肝脏中脂滴含量增高，并且在禁食后尤为明显的脂滴累积表型。作者还在文中就ORP8定位脂滴的可能机制、脂滴分解代谢中脂解作用与脂滴自噬的潜在关系等进行了讨论。

总之，该项研究发现并鉴定ORP8是介导脂滴自噬的特异受体，系统解析了ORP8的作用机理及其调控机制，这些发现对深入理解脂滴自噬过程及其在细胞脂质代谢中的作用，以及脂肪肝等脂质代谢性疾病的发生机理等有重要意义。

浙江大学医学院博士研究生浦懋懋和郑文慧为该论文的共同第一作者，浙江大学医学院刘伟教授和Dante Neculai教授为共同通讯作者。

https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac063/6881074

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