JACS：精氨酸ADP-核糖基化：翻译后修饰泛素蛋白的化学合成

导读

近日，荷兰莱顿大学医学中心Dmitri V. Filippov和Gerbrand J. van der Heden van Noort团队在JACS上发表了题为“Arginine ADP-Ribosylation: Chemical Synthesis of Post-Translationally Modified Ubiquitin Proteins”的文章，开发和优化了用腺苷-二磷酸-核糖基（ADPr）基团制备在精氨酸残基上修饰的肽和蛋白质的方法。该方法包括将含有多肽的鸟氨酸与α-连接的异硫脲N-核糖苷反应，随后在核糖基部分的5′-羟基处安装磷酸单酯，然后转化为二磷酸腺苷。作者使用这种方法获得四种ADP-核糖基化泛素（UbADPr）的区域异构体，实现了在泛素（Ub）蛋白内不同精氨酸位置上的ADP-核糖基残基修饰，是作为完全合成精氨酸连接ADPr修饰蛋白的首例报道。

正文

细胞内蛋白质的翻译后修饰（PTM）会影响蛋白质的功能、定位和广泛的细胞信号传导过程。PTM包括相对较小的基团，如磷酸盐或甲基，但也可能涉及更复杂的分子实体，如（多）糖苷和ADP-核糖（ADPr）部分，甚至整个蛋白质，如泛素（Ub）。在ADPr的情况下，单ADP-核糖基转移酶（mARTs）通过靶蛋白中的亲核氨基酸侧链催化烟酰胺从β-NAD中置换，从而通过α-构型的核糖键有效地将ADP-核糖连接到蛋白质。与大多数PTM一样，ADP-核糖基化是一个高度动态的过程，特异性写入器（mART）和橡皮擦（ADPr-水解酶（ARH））酶可以作用于特定的蛋白质或氨基酸。精氨酸残基的δ-胍基团的ADP-核糖基化通常由ART-C亚家族催化。军团菌使用SidE蛋白（SdeA、SdeB、SdeC和SidE）劫持真核宿主细胞的泛素途径，并以非常规的方式泛素化宿主细胞蛋白。这种多步骤级联从军团菌SidE mART结构域开始。随后，SidE中的磷酸二酯酶（PDE）结构域催化宿主细胞底物蛋白的丝氨酸与精氨酸连接的Ub之间形成磷酸二酯键ADPr同时排出一磷酸腺苷（Fig. 1B）。通过这种方式，细菌效应酶通过精氨酸-磷酸核糖键有效地将宿主Ub连接到宿主底物蛋白。

Fig. 1: （A）本研究提出的进展和（B）嗜肺乳杆菌酶用于（去）泛素化宿主细胞底物蛋白的途径的示意。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者团队和其他人之前已经报道了ADP-核糖基化肽的合成，其中ADP-核糖连接到Ser、Thr或Cys、和Asn、Gln以及非天然氨基酸（Fig. 1A）。本文中，作者开发了一种普遍适用于在精氨酸上合成ADP核糖基化肽的方法，并将这种策略扩展到天然连接的ADP-核糖基化蛋白Ub ADPr 的全化学合成。首先，作者进行了异硫脲核糖苷的合成。该化合物的合成始于5-O-((tert-butyl)-diphenylsilyl)-β-d-ribofuranosyl azide 2（Scheme 1A）。经过尝试，在硅藻土垫上过滤除去催化剂后，无需进一步处理或纯化所得滤液即连接异硫氰酸酯。最后，分别以64%和12%的产率获得核糖基异硫脲1α和1β。

Scheme 1. 精氨酸连接的ADPr肽的合成方案。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

得到核糖基异硫脲1α之后，作者在树脂上进行了模型七肽14（Ac-GRADPrLIFAG-OH）的合成（B）。肽14来源于人Ub蛋白，含有已知在Arg42残基上被嗜肺乳杆菌效应酶ADP核糖基化的氨基酸。N δ -Alloc保护的鸟氨酸被掺入肽序列中ADP-核糖基化位点上。经过Alloc保护和脱保护，使用AgNO 3 作为路易斯酸将构建单元1α对肽6进行胍基化修饰。LC-MS分析显示完全转化。接下来，对核糖基部分上的5′-OH进行脱硅烷、对伯醇进行磷化和P III 到P V 氧化。对肽11的脱保护制备了用于P V 到P III 与以TBS和Boc为保护基团的腺苷酰胺12偶联。随后，用DBU去除焦磷酸部分上的氰乙基保护基团，得到受保护的肽-ADPr13。最后，在DCM中使用10%三氟乙酸（TFA）从树脂中裂解肽，经RP-HPLC纯化分离出肽14（总产率为9.3%），这是首个合成Arg连接的ADPr肽的例子。同时，尽管用于胍基化反应的异硫脲核糖是纯α-构型，作者通过 1 H NMR观察到异构体的混合物比例为6：4（α / β）。

接下来，作者的合成方法从肽推断到蛋白质。化学合成 Arg42 UbADPr使用类似于获得肽14的方案进行，并通过小树脂样品的测试裂解进行监测。首先，经过脱保护暴露鸟氨酸部分的胺，与1α的树脂上胍基化反应顺利进行。随后的磷酸化、氧化和P V –P III 偶联产生完全保护的树脂结合 Arg42 UbADPr。作者通过孵育Ub ADPr 证实了这种酸在TFA（90.5%）中1.5小时的稳定性（和庚聚体14）。使用这些条件，从树脂中完全裂解和整体脱保护，然后进行HPLC纯化，得到合成的 Arg42 Ub ADPr18的总收率为1.8%。通过在SPPS期间将N δ -Alloc保护的鸟氨酸结合在蛋白质的另一位置，可以直接将ADPr基团引入到Ub中的其它精氨酸残基。作者成功地在Ub的Arg54、Arg72或Arg74上引入了UbADPr，获得共轭物19–21，总分离产率分别为1.8%、1.2%和1.7%。

为了研究军团菌效应酶（DUPs）是否能够水解所合成的ADPr肽中的焦磷酸盐，作者将Ub衍生的Arg-ADPr七肽14与DupA孵育，并使用 1 H NMR进行了表征。结果证实了合成的Arg-ADPr肽被酶的催化活性识别和加工。此外，DupA似乎更喜欢α而不是β，水解α-构型的Arg-ADPr肽14（大约1.5 ×）比其β-异构体更快。这也与之前的报道相一致。

受到DupA处理合成ADPr肽这一事实的鼓舞，作者接下来着手比较水解速率与酶促产生 Arg42 UbADPr的水解速率。将合成的ADPr肽在缓冲溶液中在DupA存在下进行孵育，并在指定时间使用高分辨率质谱分析（Fig. 2C）。在该水解测定中，酶 Arg42 UbADPr在30分钟内被DupA完全水解至 Arg42 UbPr。泛素衍生的庚聚体14和15的速率低于 Arg42 UbADPr，90分钟后分别显示48%和52%的水解。

接下来，作者通过DupA孵育各自的UbADPr类似物，研究了所合成的4个Ub ADPr 蛋白18−21的识别和水解情况，并与酶制备的 Arg42 Ub ADPr 进行了比较。 Arg42 UbADPr在没有DupA的缓冲液中，长时间内不会导致水解。合成的 Arg42 UbADPr18和Arg42衍生的UbADPr庚聚体14几乎完全加工，酶 Arg42 UbADPr也是如此。尽管 Arg74 UbADPr低于 Arg42 UbADPr，但 Arg74 UbADPr的水解程度明显高于 Arg54 UbADPr和 Arg72 UbADPr。执行类似的测定并分析较早时间点（15-90分钟）的转换显示酶 Arg42 UbADPr15分钟后完全水解。 Arg42 UbADPr在这段时间内水解不太明显（30分钟后为52%）和（90分钟后为65%）（Fig. 3B），而其它三个UbADPr通过Arg72，Arg74和Arg54连接的DupA水解明显较少，佐证了DupA对Arg42的偏好。 Arg42 UbADPr可能是以与酶 Arg42 UbADPr相当的速度处理α-异构体。

Fig.3. DupA介导的UbADPr水解成UbPr。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者的下一个目标是研究军团病发病的关键生物过程SdeA介导的底物ER蛋白与Ub ADPr 的连接。作者合成了一种20聚体肽，来源于已知是SidE效应子底物的ER重塑RTN4b蛋白（23），在N-末端连接罗丹明荧光团。正如已经报道的那样，SdeA偶连 Arg42 Ub ADPr 到肽23形成磷酸核糖连接 Arg42 Ub-RTN4b产物（Fig. 4A）并显示焦磷酸键的部分水解至 Arg42 UbPr。这证实了肽23是诱导PDE介导的连接 Arg42 Ub ADPr 的合适底物，并且四种合成泛素18-21也可以参与这一过程。

Fig.4. SdeA介导的UbADPr连接荧光RTN4b 20-聚体片段23。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

荷兰莱顿大学医学中心Dmitri V. Filippov和Gerbrand J. van der Heden van Noort团队开发了在精氨酸连接ADPr肽和蛋白质UbADPr的方法，是携带天然精氨酸键的ADP核糖基化蛋白质的首次全化学合成。ADPr肽和ADPr泛素区域异构体在水解和连接测定中能够被军团菌效应子（DupA和SdeA）识别。在精氨酸残基上进行定点引入ADPr的能力可以获得生化方法无法的得到的明确定义材料，并且在水解测定中，军团菌效应子DupA和SdeA有利于Arg42UbADPr联动。毫无疑问，该方法为肽和蛋白质提供天然ADPr氨基酸连接，用于分析参与安装和去除ADPr修饰的酶的位点特异性。

文献详情：

Jim Voorneveld, Max S. Kloet, Sven Wijngaarden, Robbert Q. Kim, Angeliki Moutsiopoulou, Marnix Verdegaal, Mohit Misra, Ivan Đikić, Gijsbert A. van der Marel, Herman S. Overkleeft, Dmitri V. Filippov*, and Gerbrand J. van der Heden van Noort*. Arginine ADP-Ribosylation: Chemical Synthesis of Post-Translationally Modified Ubiquitin Proteins, J. Am. Chem. Soc. 2022. https://doi.org/10.1021/jacs.2c06249