上海
撰文 | 雪月
责编 | 酶美
CTLA不足是一种先天性免疫缺陷（inborn error of immunityIEI，原发性免疫缺陷），由CTLA-4杂合种系突变引起，会造成严重的疾病。CTLA-4不足首次被发现是在2014年，大多数致病突变出现在外显子2和3中。CTLA-4是重要的负性免疫调节分子，CTLA-4与CD28具有竞争性的共享配体CD80和CD86。CTLA-4结合其配体并将其从抗原提呈细胞中去除，从而减少CD28共刺激所需的配体，导致免疫抑制。与健康对照组相比，CTLA-4不足的患者体内Treg细胞比例显著增加，效应T细胞过度激活。通常患者会在20岁之前出现反复感染、自身免疫病以及淋巴组织增生，导致死亡。尽管CTLA-4融合蛋白模拟物abatacept 和belatacept能够改善症状，但是仍然需要系统的给与免疫抑制来控制自身免疫反应。异体造血干细胞移植是目前唯一的治疗方法，但是也伴随着移植物导致的高死亡率和移植物抗宿主病的高风险。
自体基因治疗（Autologous gene therapyGT）是一种具有前景的治疗方法，没有异体造血干细胞移植导致的高风险并发症。而且GT已经成功用于治疗其他IEI。其方法是将基因半随机整合到基因组中，由人工启动子驱动表达。但是在功能获得性疾病和单倍体不足中，特定的基因编辑方法或许更能满足生理性的、动态性以及细胞特异性蛋白表达的需求。CRISPR-Cas9等基因编辑技术可以纠正遗传缺陷，同时保留内源性基因调控机制。基因编辑细胞疗法已经开始用于治疗单基因遗传病，并在镰刀细胞病以及地中海贫血方面有了不错的进展。大多数IEI的GT方法会修饰造血干细胞以实现基因表达可以跨越所有造血谱系。但是对于主要影响淋巴细胞的疾病，T细胞功能的恢复或许就能治愈。T细胞GT的毒性会大大降低，插入诱变风险小。
来自英国伦敦大学学院的Emma Catherine Morris团队在Science Translational Medicine上发表题为Therapeutic gene editing of T cells to correct CTLA-4 insufficiency的文章。该研究开发了普遍适用的内含子基因编辑疗法，可以改善CTLA-4不足导致的临床症状，恢复CTLA-4的表达以及功能。
为了证明CTLA-4基因编辑可行性以及优化在人T细胞中的编辑策略，作者首先使用CRISPR-Cas9/AAV6将GFP插入到CTLA-4开放阅读框中，并利用gRNA在外显子2中产生双链DNA断裂。随后使用AVV6供体模板进行修复。通过流式检测来评估同源定向修复水平，修复率为55.8%。接下来作者从携带c.370A>C 点突变的患者身上分离T细胞，使用gRNA2/cas9和同源定向修复供体进行编辑。之后检测CTLA-4的荧光强度值，发现编辑后，突变组与对照组的差别不再显著。由于gRNA仅针对突变的等位基因，作者未观察到CTLA-4被敲低的现象。这些数据表明该方法用于定向修复突变患者基因组可行。
但是临床中已经报道的突变有50多种，上述定向修复在临床中不具有可行性。于是作者检测评估了几种普遍适用的编辑策略，包括靶向外显子1，修复率为42.5%。第二种靶向3’第一个内含子，插入正常基因的cDNA，这可以纠正多数疾病引起的突变，又避免在剩余健康等位基因编码区引入插入缺失，而CTLA-4的表达又能保持完整。作者对第二种方法做了深入验证。
作者验证发现内含子编辑方法产生的功能性CTLA-4保留了与对照组类似的转内吞CD80和CD86的能力。作者评估被编辑的T细胞产生细胞因子的能力，发现刺激细胞后细胞因子产生的能力正常。而用这一方法对患者来源的T细胞进行编辑发现，该方法在三种不同的杂合突变患者来源的T细胞中可以恢复CTLA-4的表达和功能。最后作者在CTLA-4敲除小鼠中进行体内验证。该小鼠会出现多器官淋巴细胞浸润导致的致死性淋巴增生综合征。编辑发现CTLA-4被编辑后的T细胞可以在体内存活，并且表达CTLA-4，编辑后CTLA-4不足的临床症状得到控制。
本研究开发了一种广泛适用的内含子基因编辑方法，可以纠正CTLA-4不足造成的T细胞免疫缺陷。作者用患者T细胞体外以及小鼠体内模型证明了治疗方法的可行性，可以消除临床症状。
http://doi.org/10.1126/scitranslmed.abn5811
制版人：十一
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