微源实验室液相色谱串联质谱检测血清粪便中13种胆汁酸含量

胆汁酸是参与基本生理过程的胆固醇衍生分子，是哺乳动物内重要的内源性物质，具有促进脂类吸收，帮助药物、维生素和内源性、外源性物质的吸收和排泄等多种重要生理功能。其中初级胆汁酸由胆固醇在肝脏中分泌，而次级胆汁酸由初级胆汁酸在肠道菌群的作用下去羟基化合成。绝大部分初级胆汁酸经由肝肠循环为机体回收利用，大约5%的胆汁酸进入结肠，并由肠道微生物代谢为肠道胆汁酸代谢物。

按结构胆汁酸可分为两大类，一类是游离型胆汁酸，包括胆酸（CA），去氧胆酸（DCA），鹅去氧胆酸（CDCA），熊去氧胆酸（UDCA）和石胆酸（LCA）。另一类是结合型胆汁酸，为上述游离型胆汁酸与甘氨酸和牛磺酸的结合物，有甘氨胆酸（GCA），牛磺胆酸（TCA），甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA），牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA），甘氨去氧胆酸(GDCA)，牛磺去氧胆酸(TDCA),甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)，牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，甘氨石胆酸(GLCA)，牛磺石胆酸(TLCA)。

随着人们对代谢性疾病的广泛关注，已有诸多研究表明在一些代谢性疾病中，胆汁酸以及胆汁酸信号通路已经成为潜在的治疗靶点。研究发现，补充胆汁酸可以改变胆汁酸池和肠道菌群的组成，另外在临床和实验诱导的肝脏损伤引起的胆汁酸水平下降可能导致肠道细菌过度生长。[1]胆汁酸的代谢与肝胆疾病密切相关，因此其质和量的变化对肝胆疾病的诊断、鉴别诊断及机理研究具有重要价值。但是由于胆汁酸存在种类多，结构复杂，同分异构体较多，极性差异大的特点，使得胆汁酸的分离分析十分困难。

目前胆汁酸的分析测试方法主要包括分光光度法、气相色谱（GC-MS）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）等。其中的部分方法存在灵敏度低、操作程序繁琐、检测时间长等缺点，液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）结合了液相色谱的良好分离性能和串联质谱的高灵敏、高特异性检测的优点，已经成为目前临床生化小分子标志物的推荐分析测试方法，可以适用不同亚型胆汁酸的同时定量分析测试。

杭州微源检测实验室开发利用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）检测胆汁酸以待测目标物的同位素标记物为内标，测定人血清中胆汁酸有胆酸（CA）、甘氨胆酸（GCA）、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA）等13种胆汁酸的浓度。

色谱柱使用Phenomenex（GeminiNX3µC18110A100×2.0mm）进行分离，流动相选用水（含0.1%甲酸和0.5%氨水）作为A相，和乙腈作为B相，柱温设为40℃，进行梯度洗脱，采用电喷雾离子源（ESI）和多反应监测（MRM）模式进行质谱扫描。离子源参数：加热气（GS1）和辅助加热气（GS2）分别为55和45psi，脱溶剂气温度为600℃；气帘气（CUR）为30psi，碰撞气（CAD）为6psi；喷雾针（IS）电压为-3500V。

样品处理将血浆样品50µL，先后加入25µL250nM的胆汁酸混合内标溶液和150µL乙腈，混匀，15000rpm4℃离心10min，转移上清液100µL，再加入100µL纯水稀释，混匀，取上清液10µL，进入LC-MS/MS进行分析测试。分析结果13种胆汁酸的回归方程和线性范围如下表，相关系数均大于0.997，胆汁酸在相应的浓度范围内线性良好。

利用LC-MS/MS三重四极杆质谱检测胆汁酸含量能够使胆汁酸达到良好的基线分离，方法灵敏度、耐用性良好，能够在短时间内同时定量分析检测血浆或粪便中十余种胆汁酸的浓度。该方法稳定、检出限低、分离度好，能够满足临床试验中生物标志物的检测需求。为胆汁标本的分析提供了一种简单、切实可行测试操作方法。微源检测实验室拥有完善的配套设施和专业的检测人员，遵照ISO17025和GMP等高标准进行实验室管理，利用色谱质谱等多类专业检测仪器，为生物医药等领域伙伴产品生产过程中可能产生的杂质提供评估报告、方法开发、验证及样品检测等一系列完整的解决方案。

参考文献：[1]CaiJ,SunL,GonzalezFJ.Gutmicrobiota-derivedbileacidsinintestinalimmunity,inflammation,andtumorigenesis[J].CellHost&Microbe,2022,30(3):289-300.