肺再生过程中的修复细胞龛：p16INK4a成纤维细胞

撰文丨十一月

p16INK4a是由Cdkn2a（Cyclin-dependent kinase 2a）位点编码的肿瘤抑制因子，在体外培养的细胞系中会促进衰老【1】，这一表型通常是由应激胁迫引起的细胞周期阻滞，并与细胞的分泌谱相关。先前的研究通过建立p16INK4a启动子驱动荧光素酶表达的报告因子小鼠曾经发现p16INK4a的转录增加与衰老和伤口修复有关【2-4】。但是目前p16INK4a细胞在其组织内的细胞生态系统中的身份和行为在很大程度上仍不清楚。为此，美国加州大学旧金山分校Tien Peng研究组在Science发文题为Sentinel p16INK4a+ cells in the basement membrane form a reparative niche in the lung，通过设计高敏感性p16INK4a报告基因，发现p16INK4a成纤维细胞感应组织炎症的能力增强的，并通过增加分泌能力来促进组织再生的功能。

为了构建组织中高敏感p16INK4a报告基因，作者们建立了细菌人工染色体品系，其中融合了组蛋白与绿色荧光蛋白的串联信号（H2B-GFP）同时表达Cdkn2a位点上的p16INK4a基因产物（图1）。通过流式细胞分选，作者们发现出生后60天的年轻野生型小鼠肺部没有出现荧光细胞，但是在p16INK4a高敏感报告基因品系INKBRITE中则会出现GFP富集的细胞。通过进一步细胞谱系标记，作者们发现GFP所标记的细胞大多数是免疫细胞类型（CD45+）以及成纤维细胞（PDGFRalpha+）（图1）。

图1 p16INK4a高敏感报告基因品系

随后，通过BrdU招募实验，作者们发现在肺泡形成过程中，p16INK4a成纤维细胞中BrdU的结合显著减少，但与不表达p16INK4a成纤维细胞相比，成年稳态期间BrdU的结合并没有显著降低。因此，作者们发现p16INK4a成纤维细胞构成了一个稳定的、组织固定细胞群体，特征是在出生后发育和稳态期间基底膜内复制较慢。多细胞核是体外培养成纤维细胞衰老的其中一个特征【5】。通过对p16INK4a成纤维细胞染色，作者们发现该成纤维细胞亚群中双细胞核以及多细胞核的比例更高，而且具有 γH2AX等衰老细胞标记物染色特征。

p16INK4a高敏感报告基因品系INKBRITE中被GFP标记的细胞表达量存在异质性表达，因此作者们将该群细胞依据GFP的表达分为GFPhi高表达以及GFPlo低表达细胞。作者们通过细胞分裂稀释染料CellTrace Far Red的处理发现GFPhi成纤维细胞中CellTrace Far Red的滞留更多，说明GFPhi成纤维细胞的分裂更慢，细胞周期滞留时间更久。

细胞周期滞留可能与衰老以及静息状态相关，先前的研究发现肺部加入分裂原刺激会导致细胞表现出低周转率。萘（Naphthalene）会造成肺部气管上皮损伤，损伤修复再生伴随着气管干细胞以及成纤维细胞的增殖【6-7】。作者们发现在萘损伤后，GFPhi免疫细胞数量增加，但是成纤维细胞增殖比例降低。

进一步地，作者们对p16INK4a成纤维细胞转录特征进行分析，发现细胞中衰老相关的分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype，SASP）增加。进一步地，为了揭开p16INK4a成纤维细胞在肺部损伤过程中对气管干细胞的作用，作者们将气管干细胞与p16INK4a成纤维细胞中GFPhi、GFPlo以及GFP-的细胞体外分别共培养，发现GFPhi的p16INK4a成纤维细胞可以促进上皮干细胞的再生，而这主要是通过分泌生长因子促进的气管屏障的修复。

为了检测p16INK4a成纤维细胞能否直接感应炎症刺激，作者们使用了细菌壁组分进行脂多糖处理，作者们发现会导致GFPhi成纤维细胞中出现SASP转录响应。进一步通过相互作用组（NicheNet）分析，作者们发现白介素IL-1家族高表达，促进干细胞损伤修复。当通过慢病毒表达短发夹RNA靶向敲低p16INK4a成纤维细胞，作者们发现会抑制免疫响应、促进成纤维细胞增殖，并且抑制对于气管干细胞再生的促进作用。

总的来说，作者们的工作设计了一种超灵敏的p16INK4a报告基因，发现在肺上皮干细胞邻近的基底膜中具有一定衰老特征的表达p16INK4a的成纤维细胞。这些p16INK4a成纤维细胞能够感知组织炎症，并通过增加分泌能力来促进上皮再生。该研究揭示了p16INK4a成纤维细胞作为干细胞生态位中哨兵的作用，可以监测屏障的完整性并对炎症迅速反应，从而促进组织再生。

http://doi.org/10.1126/science.abf3326

制版人：十一

参考文献

1. F. Zindy, D. E. Quelle, M. F. Roussel, C.J. Sherr, Oncogene15, 203–211 (1997).

2. S. Takeuchi et al.,Cancer Res.70, 9381–9390 (2010).

3. C. E. Burd et al.,Cell152, 340–351 (2013).

4. M. Demaria et al.,Dev. Cell31, 722–733 (2014)

5. P. A. Benn,Am. J. Hum. Genet.28, 465–473 (1976).

6. K. U. Hong, S. D. Reynolds, A. Giangreco, C. M. Hurley, B. R. Stripp,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.24, 671–681 (2001).

7. T. Peng et al.,Nature526, 578–582 (2015).

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