FSHW | 结肠炎患者开饮或有益：从小麦胚芽及苹果的乳酸菌发酵液中发现了缓解溃疡性结肠炎的新寡肽

Introduction

溃疡性结肠炎是一种可导致持续性腹泻、腹痛、痉挛、直肠出血和疲劳的肠道疾病。溃疡性结肠炎患者的生活质量显著下降，且还会显著增加结直肠癌、血栓和原发性硬化性胆管炎的风险。在过去几年中，溃疡性结肠炎的全球发病率迅速增加。目前治疗溃疡性结肠炎的常用药物如免疫抑制剂、抗生素和皮质类固醇等的应用可以一定程度有效抑制UC发病时的炎症，但这些治疗药物都有不同程度的副作用，且无法有效治愈溃疡性结肠炎。

食物中生物活性肽可能成为一种很有希望的替代药物，为溃疡性结肠炎患者提供更方便、更安全的预防性治疗方法。生物活性肽可以存在于食品中，也可以从富含蛋白质的饲料秸秆的蛋白质消化和微生物发酵中获得。据报道，一些食物来源的生物活性肽具有抵抗胃液和肠液消化的能力，它们成功到达肠道并通过肠道屏障，从而在肠道和全身水平发挥生物效应。由于其潜在的生理特性及更高的安全性，生物活性肽正在被开发成为缓解肠道炎症和肠黏膜损伤的治疗剂。例如，从胃窦黏膜蛋白中衍生的生物活性肽可降低右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠损伤小鼠的黏膜侵蚀程度和临床严重程度。一种名为LFP-20的20个氨基酸的抗菌肽可增加紧密连接蛋白ZO-1的表达，并降低了脂多糖诱导的小鼠结肠上皮的通透性和凋亡。抗炎大豆肽Val-Pro-Tyr可减少TNF-α诱导的Caco-2细胞中的IL-8分泌，并降低DSS诱导的小鼠模型中结肠炎的严重程度。这些活性肽具有（或部分具有）调节免疫反应、抑制肠道炎症和减轻肠黏膜损伤的生物学能力，从而在减轻肠道炎症方面发挥积极作用。

小麦胚芽中含有丰富的蛋白质及多种必需氨基酸，是生物活性肽的理想来源。目前研究人员已经从小麦胚芽的蛋白酶水解或发酵后产物中分离提取到多种生物活性肽如抗氧化肽、钙结合肽和抗菌肽等。 广东工业大学轻工化工学院何东讲师，清华大学化工系曾文博士生及邢新会教授等 在之前报道的研究中使用四种乳酸杆菌的混合培养物对新鲜小麦胚芽及苹果混合果汁进行发酵并通过乙醇进行提取及浓缩获得的发酵产物醇溶组分（AC-WGAF）对DSS诱导的小鼠实验性结肠炎具有明显的预防及保护作用，可以显著减轻DSS诱导的结肠炎引起的紧密连接蛋白表达缺失。对AC-WGAF的成分分析表明发酵后多肽的含量显著增加，因此推测AC-WGAF可能含有某些生物活性肽具有缓解溃疡性结肠炎的作用。

广东工业大学轻工化工学院何东讲师，清华大学化工系曾文博士生及邢新会教授*等 在本文通过采用膜超滤、循环制备高效液相色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间/飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）等方法对AC-WGAF衍生的抗结肠炎肽进行鉴定和表征，并通过细胞及动物模型研究其缓解溃疡性结肠炎活性和可能的作用机制。

Results and Discussion

AC-WGAF中缓解结肠炎生物活性肽的筛选与鉴定

如图1a所示，通过不同孔径的膜过滤从AC-WGAF获得四种具有不同的分子量（＞30、10～30、3～10和＜3 kDa）组分。如图所示，分子量＜3 kDa的组分显著缓解了DSS处理下ZO-1表达的降低，这表明AC-WGAF的大部分活性组分富集在分子量较小的组分中。因此，对AC-WGAF中＜3 kDa的组分利用循环制备液相色谱进一步分离获得11个峰（F1～F11）组分。在11种组分中，F6组分的效果最为显著。为了进一步鉴定潜在的活性肽序列，收集F6部分并进行MALDI TOF/TOF MS分析，最终鉴定得到四种新的活性肽，分别命名为T24（PVLGPVRGPFPLL）、T26（YQEPVLGVR）、T27（WNMNMTA）和T28（CCNFCMS）。

图1通过超滤和循环制备型HPL筛选和收集肽

生物活性肽对紧密连接蛋白表达的影响

利用DSS诱导结肠上皮细胞模型（NCM460）进一步验证四种生物活性肽对紧密连接蛋白的影响，并通过Western blotting实验评估紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1和ocludin的表达。如图2所示，与对照组相比，单独使用DSS治疗时，NCM460细胞中ZO-1、claudin-1和occludin的表达显著降低。所有四种肽都减轻了ZO-1、claudin-1和occludin的降低情况。其中，肽T24对NCM460细胞的保护作用最为显著（P＜0.01）；因此，选择该肽进行进一步研究。

图2生物活性肽对紧密连接蛋白表达的影响

T24的抗结肠炎活性评价

采用DSS诱导的UC小鼠进一步评估T24的体内抗结肠炎活性。如图3所示，与对照小鼠相比，DSS处理的小鼠表现出更严重的腹泻症状、直肠大出血和体质量显著减轻（P＜0.001），血清IL-6表达显著增加（P＜0.001）、脾脏指数增加（P＜0.01）和结肠长度缩短（P＜0.05）。口服和皮下注射T24均可显著降低UC小鼠的血清IL-6表达和脾脏指数。在口服T24的UC小鼠中，体质量减轻和结肠长度增加的减少并不显著。相反，皮下注射T24可显著改善UC小鼠的体质量减轻（P＜0.05）和结肠长度缩短（P＜0.05）。总的来说，与口服T24相比，皮下注射T24大大减轻了UC小鼠的疾病进展。

图3 T24抗结肠炎活性评价实验

T24通过提高ERK和mTOR表达对细胞增殖的影响

采用免疫组织化学方法检测小鼠结肠组织中磷酸化ERK、磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K、NF-κB p65和Ki67的表达。如图4所示，与对照组相比，DSS诱导的UC小鼠中磷酸化ERK、磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K和Ki67的表达显著降低。同时，在DSS诱导的UC小鼠中观察到NF-κB p65的激活，表明体内结肠上皮存在炎症反应。在DSS诱导下，通过口服和皮下注射T24，这些因子在UC小鼠中的表达显著恢复。这些发现表明T24在体内具有激活ERK、mTOR和Ki67表达的能力。因为在Ser2448处mTOR的磷酸化表明mTORC1复合物的激活，随后在Thr 421处下游效应子p70S6K的磷酸化。mTOR-p70S6K信号通路的激活与细胞增殖相关，这与Ki67的表达升高有关，Ki67是一种众所周知的细胞增殖标志物。本研究结果表明，T24可能通过激活ERK和mTOR-p70S6K信号通路促进UC小鼠结肠上皮细胞增殖，从而恢复UC小鼠结肠上皮屏障。NF-κB p65是炎症反应的一个重要指标，在T24治疗的小鼠中，NF-κB p65的表达减轻也表明，至少在减轻结肠炎症方面，T24对UC小鼠的疾病进展起到了缓解作用。

图4 T24激活UC小鼠细胞增殖相关信号通路和标记物的体内分析

Conclusion

在AC-WGAF的基础上，分离纯化了一个能显著减轻DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的新肽序列T24。体外研究表明，T24在DSS诱导下对NCM460细胞的细胞毒性不显著，并具有显著的保护紧密连接蛋白丢失、促进上皮屏障完整性和调节MAPK信号通路的能力。在体内研究中，皮下注射T24在减轻体质量减轻、防止结肠长度缩短、改善脾脏指数、提高细胞增殖和刺激mTOR和ERK磷酸化方面显著缓解DSS诱导的结肠炎的疾病进展。本研究结果表明，通过乳酸菌发酵，可将小麦胚芽等原料转化为具有缓解溃疡性结肠炎的活性肽，因此，适当饮用一些小麦胚芽为原料的乳酸菌发酵饮料或能有助于缓解溃疡性结肠炎。

第一作者

何东，男，中国科学院博士，清华大学博士后，目前担任广东工业大学讲师，青年百人引进人才。近五年参与国家重点专项，广东省重点专项，国家自然科学基金等科研项目。主要研究方向为传统食品资源中活性物质的挖掘与组分间相互作用研究，目前对大鲵软骨素及软骨多肽的功能挖掘与机理解析、益生菌发酵制品的组分相互机理及功能挖掘与解析等方向进行了系统和深入的研究，在Trends in Food Science & Technology、Journal of functional foods、Food chemisitry、Food Science and Human Wellness等期刊发表论文十余篇；申请国家发明专利8项。

曾文，男，清华大学化工系博士研究生。主要研究方向为溃疡性结肠炎疾病表征与机制研究，多糖药物创制。目前对天然功能多糖、多肽治疗溃疡性结肠炎的功效片段挖掘与作用机制解析进行了系列研究，已在Food Science and Human Wellness、Food Chemistry、《生物工程学报》、Journal of Functional Foods、Chinese Journal of Chemical Engineering、Carbohydrate Polymer等期刊发表多篇论文。

通信作者

邢新会，清华大学化工系教授，生物医药与健康工程研究院主持工作副院长、博士生导师。主要研究领域：生物化工，生物育种及高通量微流控细胞培养/筛选技术与装备、酶工程、多糖多肽创制。团队坚持以问题为导向的工程科学思路，形成了基础和应用研究、技术和装备并重的学术特色，通过基础研究支撑应用转化，成功实现了多项科研成果的产业化应用。已在国内外学术刊物发表论文300余篇，H因子48（WoS），合作著书8本，译著教材2部，英文专著1部，获得发明专利80余件，其中3件国际专利，10余件专利转化应用。2002年至今担任清华大学化工系生物化工研究所所长，2009年至2018年6月担任清华大学化工系副主任。2019年6月至今，担任清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程国际研究院教授。任第十、十一、十二届全国政协委员，中国侨联委员，北京市侨联副主席，清华大学侨联主席，北京市侨联特聘专家。担任Journal of Future Foods科学主编，Biochemical Engineering Journal副主编，《生物技术产业》（现更名为《合成生物学》）、《中国酿造》、《食品科学》、《生物工程学报》、Food Sciences and Human Wellness、Enzymatic and Microbial Technology、Journal of Biotechnology、Industrial Biotechnology编委。

Isolation and characterization of novel peptides from fermented products of Lactobacillus for ulcerative colitis prevention and treatment

Dong Hea,b,1, Wen Zengb,1, Yi Wangb, Yifan Xingb, Kang Xiongb, Nan Sub, Chong Zhangb,c, Yuan Lub, Xinhui Xingb,c,d,e,*

a School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China

b Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, China Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

c Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

d Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School, Shenzhen 518055, China

e Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen 440300, China

1 Authors contributed equally to the article.

*Corresponding author.

E-mail address: xhxing@mail.tsinghua.edu.cn

Abstract

Ulcerative colitis (UC) is an incurable and highly complex digestive disease affecting millions of people worldwide. Compared to the current therapeutic drugs, bioactive peptides are more promising and safe substances as functional foods or drugs for the prevention and treatment of UC. The alcohol-soluble components from fermentation broth by fresh wheat germ and apple (AC-WGAF) were found to be effective in UC prevention in dextran sulfate sodium-induced mice in vivo. Herein, 4 novel peptides are identified from AC-WGAF by membrane ultrafiltration, recycling preparative high-performance liquid chromatography, and matrix-assisted laser desorption–ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry, possessing anti-colitis activity via using an in vitro model. One of those peptides named T24 (PVLGPVRGPFPLL) exhibited the most remarkable anti-colitis activity by preventing tight junction protein loss, maintaining epithelial barrier integrity, and promoting cell proliferation during in vitro and in vivo studies by regulating mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Thus, T24 is a promising peptide as a functional food or novel drug for UC prevention and treatment.

Reference:

HE D, ZENG W, WANG Y, et al. Isolation and characterization of novel peptides from fermented products of Lactobacillus for ulcerative colitis prevention and treatment[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(6): 1464-1474. DOI:10.1016/j.fshw.2022.06.003.

文章编译内容由作者提供

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于2022年12月3-4日在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。