南方医科大\郑大：郝冰涛、廖世秀团队最新Nat. Commun.

第一作者：冯德龙、陈妍红、戴然然、卞莎莎、薛伟

通讯作者：郝冰涛、廖世秀

通讯单位：南方医科大学、郑州大学

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细胞表面同时表达 CD4和 CD8膜蛋白的双阳性(DP)胸腺细胞在胸腺T细胞发育中发挥重要作用。DP细胞中T细胞受体基因Tcra发生重排后，T细胞表面形成有效的TCRαβ受体，经历阳性与阴性选择，DP细胞分化为CD4或CD8单阳性(SP)胸腺细胞、调节性T细胞（Treg)或恒定自然杀伤T细胞(iNKT)以响应TCR信号传导，是适应性免疫系统中的关键未成熟T细胞。于此同时，染色质组织蛋白SATB1在DP细胞中高度表达，对调节DP细胞的Tcra重排和分化至关重要。研究者通过胸腺单细胞RNA测序以及DP细胞 bulk RNA-seq测序发现Satb1缺失改变了DP胸腺细胞的细胞特征基因表达，下调了DP细胞特异性高表达的基因群体。DP细胞特异性的超级增强子可以调控DP细胞特异性基因的表达，通过染色质构象捕获技术Hi-C实验，构建了SATB1 缺失后的DP细胞三维基因组图谱。研究发现DP细胞中SATB1缺乏可以特异性降低超级增强子之间、超级增强子和启动子之间的相互作用来降低超级增强子的活性。以上研究结果表明，SATB1在胸腺细胞发育中发挥重要作用，通过三维染色质结构全局调节DP细胞中超级增强子，进而建立DP细胞特异性。

研究背景

T淋巴细胞在胸腺中发育，人类和小鼠的大多数T细胞是αβ T细胞，表达由α和β链组成的T细胞受体（TCR）。αβT细胞在胸腺中发育的主要目的是生成具有高度多样化T细胞受体（TCR）的T淋巴细胞以识别各种外来抗原同时避免对自我抗原的反应。在分化为成熟T细胞的过程中。CD4+CD8+双阳性（DP）胸腺细胞位于αβT细胞发育的中心环节。DP细胞T细胞受体基因Tcra发生重排后后，在细胞表面产生有效的αβTCR，进而识别表达I类或II类MHC的皮质上皮细胞，再加上识别自体肽从而进行阳性和阴性选择。TCR信号诱导DP细胞分化为CD4+单阳性（SP）、CD8+单阳性（SP）、调节性T细胞（Treg）或恒定自然杀伤T细胞（iNKT）。因此是适应性免疫系统中重要的胸腺T细胞发育阶段。然而目前还不清楚DP胸腺细胞是如何协调表达程序以实现有效的Tcra重排和适当选择。

特殊AT结合蛋白1（SATB1）是一种染色质组织蛋白，结合DNA序列,并分布于染色质基质中，形成SATB1四聚体，介导空间染色质结构的相互作用。于此同时，SATB1通过募集组蛋白乙酰化酶p300或组蛋白去乙酰化酶（HADC)分别激活或抑制基因转录表达。有研究表明，SATB1参与了胚胎发育、神经发生、造血和红细胞生成的过程。目前大多数关于SATB1的研究集中于它在T细胞发育中的作用，部分原因是因为SATB1在胸腺细胞发育过程中特别是在DP阶段表达量最高。有文献报道SATB1是建立Treg细胞特异性超级增强子的先驱转录因子。SATB1在激活谱系特异性基因如ThPOK、Runx3、CD4、CD8和Foxp3中起到一定作用。郝冰涛教授前期研究报道了SATB1介导抗绝缘子元件与Rag1基因启动子相互作用，促进Rag1和Rag2在DP胸腺细胞中的高表达。然而，DP胸腺细胞中其他基因的表达是否以及如何在SATB1介导的染色质组织水平上受到调节仍然未知。

图文导读

在本研究中，研究人员首先利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术分析了Satb1f/f × Vav-cre小鼠（造血系统Satb1缺陷小鼠）胸腺细胞中的发育情况，发现Satb1缺失导致胸腺DP细胞亚群发生变化（图1-a），Tcra重排相关基因Rag1,Rag2表达下降。为了进一步探讨SATB1在胸腺DP细胞发育的分子机制, 研究者在分选的DP细胞中进行多细胞转录组测序（bulk RNA-seq），发现Satb1缺陷后，表达上调基因往往在胸腺T细胞发育早期（DN1，DN2）高表达，而下调基因表达高峰在DP阶段(图1-b)，并与T细胞激活、分化相关，这些生物学过程在DP细胞中发挥着重要作用，通常被细胞特异超级增强子所调控。因此，研究人员根据H3K27ac ChIP-seq数据，鉴定得到DP细胞特异性的超级增强子，发现相关基因在DP细胞中特异性高表达（图1-c），同时其位点有很高的SATB1占有率(图1-d)。而在Satb1缺失后，超级增强子区域H3K27ac 水平下降(图1-e)，超级增强子相关基因表达显著下降(图1-f) 。研究者同时观察到，Satb1 在超级增强子区域是成簇分布的，当利用SATB1 ChIP-seq 数据鉴定 Satb1 超级成簇子（Super clusters）时，其关联的基因集在胸腺DP细胞中高表达(图1-g)，并与超级增强子关联基因高度富集在相同的DP细胞生物学过程(图1-f)。有文献报道SATB1可通过招募组蛋白乙酰化酶CBP/p300来激活转录，这表明SATB1可能通过招募组蛋白乙酰化酶到超级增强子中来调节DP胸腺细胞中超级增强子的活性。

超级增强子往往远距离调控基因，SATB1作为染色质组织蛋白，是否在三维基因组结构中调控超级增强子？为了回答这一科学问题，研究人员通过原位Hi-C技术构建了Satb1 缺失 DP细胞三维基因组图谱，发现无论是增强子-启动子互作、超级增强子或SATB1超级成簇子介导的染色质互作频率，均有不同程度的下降（图2-a）。随后研究者着重研究了两个与超级增强子、SATB1相关基因位点（Bcl6、Ets2）三维基因组结构变化。其中发现超级增强子和Bcl6或Ets2处于一个拓扑关联域（TAD）或亚TAD内。在Satb1 缺陷DP胸腺细胞中，包括超级增强子和启动子在内的Bcl6和Ets2基因位点的染色质相互作用急剧减少（图2-b）。为了验证这两个基因的增强子-启动子相互作用，研究人员进行了3C-HTGTS（一种类似与4C染色质捕获检测技术）检测，结果显示在Satb1 缺失 DP胸腺细胞中Bcl6和Ets2基因的启动子与超级增强子相互作用降低；组蛋白H3K27乙酰化都出现大幅减少(图2-c)。RNA-seq、qPCR和Western blot结果均发现Satb1缺失胸腺细胞中Bcl6和Ets2的表达减少。胸腺细胞发育过程中Bcl6和Ets2表达高峰在DP阶段，这与Satb1的模式相似。以上结果表明Bcl6和Ets2在DP胸腺细胞中的特异性高表达是由超级增强子和SATB1调节的。随后，研究人员构建了这两个基因的超级增强子敲除小鼠，结果显示这两个基因表达显著下调，而胸腺细胞的发育也受到一定的影响。这进一步证明SATB1调节细胞身份基因，协调胸腺DP发育。

总结与展望

综上所述，这项工作中研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、多细胞转录组（bulk RNA-seq ）、转录因子与组蛋白ChIP-seq多组学分析了 Satb1缺失胸腺细胞的表观遗传变化，发现Satb1的缺失改变了DP胸腺细胞的身份基因表达。进一步的三维基因组分析表明，SATB1是重塑染色质相互作用来激活超级增强子的关键蛋白。研究人员验证了DP胸腺细胞中Bcl6、Ets2两个基因受SATB1和超级增强子调控。这些发现表明，SATB1通过三维基因组结构调控超级增强子，从而调控双阳性DP胸腺细胞的身份特性。这项研究成果为免疫细胞发育表观遗传研究提供了新的思路。

据悉，南方医科大学基础医学院肿瘤研究所的郝冰涛教授、郑州大学人民医院（河南省人民医院）医学遗传研究所廖世秀教授作为文章的共同通讯作者指导了这一工作。另外，加州大学洛杉矶分校Yoshinori Kohwi团队、复旦大学附属眼耳鼻喉科医院马竞团队参与了该研究。冯德龙博士、陈妍红博士、戴然然硕士、卞莎莎博士、薛伟博士为该论文的共同第一作者。

通讯作者简介

郝冰涛课题组主要从事T细胞发育中的表观遗传调控及染色质空间拓扑结构方面的研究，近年来以第一作者（共同一作）或者通讯作者身份系统解析了T细胞发育过程中染色质的空间组织以及其对T细胞受体基因Tcra重排和T细胞发育的影响，相关研究发表在Nature、Nucleic Acids Res、 J Exp Med、J Immunol 等期刊上。