液体活检之非血液来源ctDNA！

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龙生九子，各有不同。ctDNA亦是如此，除血液来源ctDNA外，常见非血液来源ctDNA亦有九种，优缺点各不相同。

近十年来，随着NGS技术的快速发展，液体活检，尤其是对ctDNA的检测，已成为一种简单且非侵入性的组织活检替代方法。

传统的ctDNA液体活检通常是指基于血液衍生的ctDNA。然而，对于液体活检技术而言，除了分析血液来源ctDNA外，还可以对其他特定器官附近的体液样本来源ctDNA进行检测分析（近端取样）以期提高检测灵敏度，如尿液、脑脊液、胸膜或腹膜液等。这种“近端取样”的非血液来源ctDNA可能在某些应用环境中具有独特的优势，并且可以替代或补充血液来源ctDNA。

2022年8月1日，《Nat Rev Clin Oncol》（IF:65.011）在线发表了一篇题为《非血液来源ctDNA》的综述，详细介绍了非血液来源ctDNA的优缺点，以及将这些非血液来源ctDNA检测方法从学术界转化为临床应用的一些挑战。1

cfDNA是指存在于细胞外且可在体液中检测到的DNA片段。ctDNA是指癌细胞释放到体液中的DNA，是cfDNA的一部分。

ctDNA通常指血液（血浆）来源，但也可以在非血液来源生物体液中直接接触肿瘤组织而产生（如尿液、脑脊液、胸膜或腹膜液等），因此这些体液中的ctDNA比例可能高于血浆，这也就意味着非血液来源ctDNA可能具有更高的ctDNA浓度及更高的变异等位基因频率（VAF）。非血液来源ctDNA可能更能反映原发性肿瘤，例如脑脊液与颅内肿瘤，胸膜液与晚期胸部肿瘤等。

当然，目前非血液来源ctDNA途径过多，与血液来源ctDNA相比，每种方法都有其优缺点。

▲ 不同癌症类型的非血液来源ctDNA研究/应用情况

血液来源ctDNA的优缺点

优点：

● 目前标准化（检测）流程可轻松获得；

● 为越来越多的实验室（检测）所熟悉；

● 微创采集可在多个时间点进行连续采样；

● 能够及早发现获得性耐药信息；

● 与组织活检取样相比，能够更好地捕获肿瘤异质性。

缺点：

● 由于克隆性造血占优势，ctDNA/cfDNA的比值较低；

● 只有某些细胞亚型可能会将ctDNA释放到血液循环中；

● 血液来源ctDNA无法代表中枢神经系统肿瘤；

● 对局限于某些解剖位置的肿瘤（如早期NSCLC和肉瘤）的代表性较差。

*通常应用于除中枢神经系统以外的肿瘤

非血液来源ctDNA的优缺点：尿液

优点：

● 完全非侵入式采样可在多个时间点进行连续采样；

● 可能在筛查中发挥作用，类似于在男性前列腺癌中筛查血清前列腺特异性抗原（PSA）；

● 由于取样方便，取样地点不受限制；

● 由于直接接触尿液，对肾细胞癌和尿路上皮癌具有潜在的高敏感性；

● 与血浆相比（无白细胞cfDNA稀释的影响），ctDNA/cfDNA的比值更高；

● 提供可能与血浆来源ctDNA检测结果互补的结果。

缺点：

● 肾小球过滤限制了经肾ctDNA含量；

尿液ctDNA由两部分组成，第一种是经肾肿瘤DNA（trtDNA），它来源于血浆并通过肾小球过滤进入尿液（通常指非泌尿系统肿瘤）；另一种是来源于直接从泌尿道脱落的肿瘤细胞DNA（ucfDNA），由于没有经过肾过滤，其分子量可能更大（通常指泌尿系统肿瘤）。trtDNA和ucfDNA两种的临床效用均被证明是可行的，并且检测结果与从组织和血浆ctDNA测序获得的结果高度一致。

● ctDNA的产率可以随着时间的变化而变化；

● 没有标准化的保存或分析方法。

*通常应用于泌尿系统癌症（前列腺癌，膀胱癌，肾癌）和非泌尿系统癌症（结直肠癌，淋巴瘤，乳腺癌和肝癌）

非血液来源ctDNA的优缺点：脑脊液

优点：

● 为原发性中枢神经系统肿瘤提供了一种替代中枢神经系统活检取样的诊断方法；

● 由于克隆性造血的干扰有限，能够在高变异等位基因频率下进行变异检测，并检测中枢神经系统局限性疾病；

● 可以诊断软脑膜（转移）疾病；

● ctDNA/cfDNA的比值高于血浆（血脑屏障导致）；

● 提供有关确定性治疗后中枢神经系统肿瘤复发风险的信息。

缺点：

● 相对于其他液体活检具有侵入性（腰椎穿刺）；

● 取样需要经过专门培训的医务人员（腰椎穿刺）；

● 难以获得大量样本或重复样本（腰椎穿刺）；

● 标准化样本收集和/或处理具有挑战性。

*通常应用于原发性CNS癌症（髓母细胞瘤，胶质瘤，淋巴瘤）和继发性CNS肿瘤（非小细胞肺癌，黑色素瘤）

非血液来源ctDNA的优缺点：胸膜液（胸水）

优点：

● 物理上接近胸膜/肺实质疾病；

● ctDNA/cfDNA的比值高于血浆；

● 周转快速，增加基因组产量补充肺/胸膜活检量不够的情况；

● 便于采集大量样本。

缺点：

● 中等侵入性采样程序，可能不适合连续采样；

● 取样需要经过专门培训的医务人员；

● 目前尚不清楚是否应该使用积液沉渣或上清液进行分析。

*通常应用于肺癌和黑色素瘤

非血液来源ctDNA的优缺点：腹膜液（腹水）

优点：

● 物理上接近腹膜疾病；

● ctDNA/cfDNA的比值高于血浆；

● 在以腹膜转移为主的癌症中，比血浆ctDNA更敏感；

● 在手术前后进行采样以评估复发风险的可能性。

缺点：

● 中等侵入性采样程序，可能不适合连续采样；

● 取样需要经过专门培训的医务人员；

● 只有在特定环境下才会使用的侵入性采样程序。

*通常应用于结直肠癌，胰腺癌，卵巢癌和阑尾癌

非血液来源ctDNA的优缺点：唾液

优点：

● 物理上直接接触口咽癌；

● 完全非侵入式采样可在多个时间点进行连续采样；

● 由于取样方便，取样地点不受限制。

缺点：

● 通常只产生低浓度的ctDNA；

● 最好与其他技术结合使用（如血液ctDNA），以分析口咽、下咽和喉部的肿瘤；

● 由于片段大小有限（40-60bp），可能需要高度特异性技术，例如电场诱导释放和测量（EFIRM）液体活检技术2。

*通常应用于头颈部肿瘤和非小细胞肺癌

非血液来源ctDNA的优缺点：精液

优点：

● 非侵入式采样可在多个时间点进行连续采样；

● 包含非常高的DNA浓度，包括大的DNA片段（180bp-15kbp）；

● 部分由前列腺产生，意味着直接接触前列腺癌；

● 精液成分降低了DNA酶（DNAse）活性。

缺点：

● 由于切除关键器官和/或正在进行的雄激素剥夺治疗，治疗后的样本收集可能具有挑战性（勃起功能障碍/联合放疗后精液量减少）；

● 只适用于患有前列腺癌的男性；

● 没有标准化的采集/保存和分析方法。

*通常应用于前列腺癌

非血液来源ctDNA的优缺点：粪便

优点：

● 物理上直接接触结直肠癌；

● 利用NGS技术分析是可行的；

● 粪便ctDNA已用于结直肠癌筛查（将非血液来源ctDNA检测转化为临床应用的最先进领域之一）。

缺点：

● ctDNA的提取具有挑战性；

● 由于存在微生物DNA，导致ctDNA成分低；

● 患者可能因厌恶（反感）不愿提供粪便样本。

*通常应用于结直肠癌，胰腺癌和胃癌

非血液来源ctDNA的优缺点：胆汁

优点：

● 胆道ctDNA浓度高于血液；

● 提供组织活检取样的替代方案，但对胆道癌来说是一种挑战；

● 可能在治疗过程中获得（支架植入术，胆囊造瘘术）。

缺点：

● 侵入性手术和分析前因素很难标准化。

*通常应用于胆道癌

非血液来源ctDNA的优缺点：子宫/阴道灌洗液

优点：

● 比宫腔镜检查和活检取样的侵入性更小，可以在门诊或诊所环境中进行；

● 阴道卫生棉条允许家庭取样。

缺点：

● 患者可能因厌恶（反感）不愿提供样本；

● 相对于其他液体活检方法，子宫灌洗可能是侵入性的。

*通常应用于子宫内膜癌

由此可见，ctDNA的常见非血液来源渠道有九种，如尿液、脑脊液、胸膜液（胸水）、腹膜液（腹水）、唾液、精液、粪便、胆汁、子宫/阴道灌洗液，优缺点各不相同（就像龙有九子，各有不同）。

▲ 常见九种非血液来源ctDNA

此外，在尝试将非血液来源ctDNA检测分析转化为临床应用时，必须克服几个挑战。

1）ctDNA的半衰期相对较短，大约2h，需要尽快处理，这对使用更具侵入性程序获得的样本（如脑脊液等）提出了挑战。此外，仍需简化从收集到处理的采样过程。

2）含有防腐剂的cfDNA稳定管（如streck管等）可以延长血浆样品中ctDNA的处理时间至48小时（或以上），而不影响检测的灵敏度，但是这些cfDNA管对非血液来源ctDNA的影响尚未确定。此外，非血液来源样本的运输和储存条件也尚未标准化。

3）目前，由于缺乏标准化的检测分析方法，非血液来源ctDNA的使用仅限于特定的研究目的和/或临床试验。如果要在临床中实施这样的检测，所选择的检测首先需要可靠的分析和临床验证。并且，每个非血液来源样本类型的ctDNA验证都需要一个单独的过程。

4）过去几年，提供基于血液ctDNA液体活检（如F1LCDx和G360 CDx）的生物技术公司数量激增，但是，能够商业化检测分析非血液来源的ctDNA的仅限于Cologuard，它被FDA批准用于粪便CRC筛查。所以，非血液来源ctDNA需要进一步临床验证，以明确治疗资格、时间或治疗选择。

5）非血液来源ctDNA的检测可能会增加血液来源ctDNA检测的灵敏度，但同时也必须注意避免增加假阳性的结果。需要制定公认的标准，用于评估非血液来源ctDNA检测的性能。

6）“近端取样”的非血液来源ctDNA可能在某些应用环境中比血液来源ctDNA具有更高的灵敏度，但其也仅限于特定的肿瘤类型（前列腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和/或结直肠癌），无法筛查多种癌症。

总之，非血液来源ctDNA的检测分析有一定的潜在好处，能够更详细的分析某些解剖位置的特定肿瘤类型和完全非侵入性的连续采样。但是，在非血液来源ctDNA的检测分析被广泛应用于临床之前，必须通过精心设计的临床试验以验证其检测结果可用于指导治疗决策并证明对患者的获益之处。

参考资料：

1.Tivey A, Church M, Rothwell D, Dive C, Cook N. Circulating tumour DNA - looking beyond the blood. Nat Rev Clin Oncol. 2022 Sep;19(9):600-612.

2.Wei F, Strom CM, Cheng J, Lin CC, Hsu CY, Soo Hoo GW, Chia D, Kim Y, Li F, Elashoff D, Grognan T, Tu M, Liao W, Xian R, Grody WW, Su WC, Wong DTW. Electric Field-Induced Release and Measurement Liquid Biopsy for Noninvasive Early Lung Cancer Assessment. J Mol Diagn. 2018 Nov;20(6):738-742.

来源：基因talks

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