单体药理-if8+ | 绞股蓝皂苷通过AMPK信号通路改善2型糖尿病小鼠肝脏胰岛素抵抗和高血糖

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Introduction

绞股蓝是一种药食两用植物，绞股蓝皂苷（Gps）是主要的活性成分，其与人参皂苷具有非常相似的药理作用，如抗癌、抗炎、预防动脉粥样硬化、抑制细胞凋亡、保护神经、降血脂和降血糖作用等。但其改善胰岛素抵抗（IR）、抑制肝脏糖异生的机制报道较少。
众所周知，原发性2型糖尿病（T2DM）主要由IR引起，IR是非酒精性脂肪性肝病的主要病因，而肝细胞损伤和肝脂肪改变会加重IR。肝脏是胰岛素作用的主要靶器官，在血糖调节和脂质代谢中发挥着重要作用。T2DM使游离脂肪酸增多和分解，在肝脏内积聚，引起脂肪毒性损伤。
腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）在调节葡萄糖稳态、胰岛素敏感性和细胞功能的各个方面发挥着关键作用。2型糖尿病患者的肝脏糖异生关键酶活性或合成增加，导致肝脏葡萄糖输出增加，引起IR的发生，这是空腹血糖（FBG）异常升高的主要原因。此外，AMPK活化磷酸化（p-AMPK）通过抑制相关转录因子在调控脂质合成中发挥重要作用。抑制糖异生相关关键酶的水平，如丙酮酸羧化酶（PC）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase），从而降低血糖浓度，控制血糖稳定性。因此，研究天然产物是否通过AMPK介导的信号通路调控糖脂代谢，改善IR具有重要的意义和价值。
沈阳农业大学食品学院硕士研究生宋梦雪、史琳副教授等在文中评价了前期工作中得到的两种绞股蓝皂苷（Gp-I和Gp-II）对高脂高糖饮食和链脲霉素诱导的T2DM小鼠的降糖机制和对肝脏的影响。图1 实验路线图

Results and discussion

Gp-I和Gp-II的细胞毒性测试

采用HepG2细胞系对2 个绞股蓝皂苷进行体外细胞毒活性评价，结果见表1。两个化合物的CC50分别为（125.76±2.47）和 (169.62±3.09) μg/mL；50 μg/mL时，细胞存活率分别为109.13%和113.27%。

表1两种化合物对HepG2细胞生长的细胞毒性分析

Gp-I和Gp-II对小鼠体重、肝脏指数、摄食量和饮水量的影响

如图2所示，糖尿病小鼠的初始体重（0周）小于空白组，因为STZ注射可能导致体重的损失。从小鼠的体重变化可发现，空白组与喂养时间呈现正相关，而模型组则是负相关，两者相比有显著的差异（P < 0.01）。比较DM、MH组、Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组小鼠的体重，经过4周的饲养，四组小鼠体重分别较初期降低了10.09 %、6.05 %、5.03 %、5.27 %，两个绞股蓝皂苷样品组小鼠的体重降低程度要低于DM组，结果说明两种绞股蓝皂苷可缓解糖尿病引起的体重减少，但各组小鼠体重差异并不显著（P > 0.05）。

糖尿病小鼠对比正常小鼠表现出逐渐增加的食物摄入量，并消耗更多的水（P < 0.01）。模型组小鼠食物摄入量从(3.19±0.65) g/10g BW升至(4.41±0.26) g/10g BW，模型组小鼠水消耗量从(10.61±1.02) mL/10 g BW升至(17.76±2.41) mL/10 g BW。给予绞股蓝皂苷灌胃处理三周后，与DM组相比，通过Gp-Ⅰ处理显著降低了糖尿病小鼠的食物摄取量（P < 0.01）。在两周的单体皂苷灌胃后，与DM组小鼠相比，通过Gp-Ⅱ的干预使糖尿病小鼠的水摄入量显著降低了（P < 0.05）；四周后，小鼠的相对进食量显著减少（P < 0.01）。实验结果表明绞股蓝皂苷单体可使糖尿病引起的口渴和多食症状得到改善。

图2绞股蓝皂苷对糖尿病小鼠体重(A)、肝脏指数(B)、摄食量(C)和饮水量(D)的影响

Gp-I和Gp-II对T2DM小鼠血糖水平和糖耐量的影响

如图3 (A)，观察0周的小鼠血糖值（初始血糖值）情况，模型组空腹血糖（24.07 mmol/L）显著高于空白组（P < 0.01），可发现模型建造成功，数据具有统计学意义。从第1周开始，MH组、Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组均表现为空腹血糖（降血糖的有效指标）不同程度的降低。与DM组对比，糖尿病小鼠因Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ的处理FBG降低显著，两组空腹血糖值在第4周较初始相比分别从(23.87±3.27) mIU/L降到(18.15±0.63) mIU/L（Gp-Ⅰ），(24.83±2.68) mIU/L降到(19.10±2.13) mIU/L（Gp-Ⅱ）分别降低了24.96％和23.08％。Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ处理4周，小鼠FBG显著低于DM组小鼠。由数据可见，模型组小鼠血糖未见下降，反而有所上升（从(24.07±3.57) mIU/L上升至(24.64±1.89) mIU/L），且四周维持较高血糖水平。证明Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ可使T2DM小鼠空腹血糖降低，进而缓解糖代谢异常。

处理4周后，进行口服葡萄糖耐量试验，结果进一步证明了绞股蓝皂苷控制T2DM血糖的作用。在服用2 g/Kg葡萄糖后，血糖值在0.5 h达到峰值，继血糖值在时间点1 h开始下降。2 h后MH组和空白组小鼠血糖水平基本恢复为OGTT初始血糖水平，即接近0 h血糖值，Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组小鼠平均血糖水平低于OGTT初始血糖水平。而模型组小鼠2 h血糖值明显高于0 h血糖值，且在OGTT测试期间血糖维持较高水平。用2小时内的血糖变化曲线下面积AUC用作OGTT结果，DM组比NC组AUC增加显著（图3C，P < 0.01）；MH组、Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组比DM组AUC降低明显（P < 0.05），均降低了超30%。结果显示，糖尿病小鼠经Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ处理后，2小时后的餐后血糖得到有效降低，证明糖尿病小鼠的糖耐量得到改善。同时可发现，Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ对T2DM小鼠的降血糖作用与盐酸二甲双胍片相似。

图3(A) 各组FBG的变化，(B) OGTT期间各组血糖曲线，(C)血糖曲线的AUC

Gp-I和Gp-II对T2DM小鼠胰岛素和胰岛素敏感性的影响

在本研究中，DM组与NC组相比，小鼠的胰岛素水平升高而糖耐量则相反。造成这一现象的原因可能是高血糖长期刺激产生大量的胰岛素，降低了体内对胰岛素的敏感性，最终导致IR。而全身胰岛素抵抗的最大来源是肝脏胰岛素信号转导通路的缺陷。T2DM血清中的胰岛素抵抗和较高的胰岛素水平对于应对葡萄糖负荷至关重要。表2为胰岛素水平和胰岛素敏感性的数据，比较FINS和HOMA-IR数值可知，模型组比空白组有明显上升，表现出胰岛素分泌过多的问题，并有IR产生。灌胃盐酸二甲双胍、Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ的三组与DM组相比HOMA-IR显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。对于QUICKI、ISI和HOMA-β的数值情况，对DM组与NC组进行了比较，发现DM组这三个指标均显著低于NC组。其中HOMA-β平均值，空白组的为107.86%，DM组为16.09 %，明显低于NC组，这表明2型糖尿病小鼠的β细胞功能受损，Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组HOMA-β显著升高。DM组胰岛素水平为(16.92±1.78)较空白组(10.21±0.94)显著升高了，但Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组与DM组相比差异并不显著，可能是小鼠个体差异。结果表明，Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ的灌胃处理虽对糖尿病小鼠胰岛素水平无显著性改善，但其减轻了胰岛β细胞损伤和提高了胰岛素敏感性，显著改善了糖尿病引起的胰岛素抵抗。

表2 各组小鼠的胰岛素水平和胰岛素敏感性

Gp-I和Gp-II对T2DM小鼠血清脂质水平的影响

DM组与空白组比较，TG，TC和LDL-C水平均发生变化，相应升高了6.0、2.0和3.4 倍，这三个指标的升高是很明显的脂代谢紊乱现象。与DM组TG和LDL-C水平相比，Gp-Ⅰ组具备明显的下降效果（P < 0.05或P < 0.01），其Gp-Ⅱ的干预处理也同样使得血清TG明显下降。除LDL-C水平以外，有研究认为TC与HDL-C的比值也是反应非酒精性脂肪肝以及心血管疾病的重要指标。各组小鼠TC与HDL-C的比值分别为(2.21±0.35)、(3.50±0.67)、(2.65±0.48)、(3.01±0.59)和(3.09±1.12)，Gp-Ⅰ组和Gp-Ⅱ组的TC与HLD-C比值比模型组分别降低了0.49和0.41。NEFA浓度增加使得肌肉中葡萄糖的摄取量减少，甘油三酯的合成增加，在肝脏中诱导糖异生，并导致β细胞衰竭。将模型组与空白组相比，发现模型组NEFA数值较空白组高了92.7%。而Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ在降低小鼠血清中的NEFA方面具备显著的效果（P < 0.05），分别降低了49.4%和31.6%。综上，对于T2DM小鼠，Gp-Ⅰ和Gp-Ⅱ对血清脂代谢水平有改善效果。

表3 不同组小鼠的血清脂质水平

Gp-I和Gp-II对T2DM小鼠AST与ALT水平的影响及肝脏的病理切片

AST与ALT水平如图4B所示，DM小鼠血清AST、ALT含量明显升高，肝损伤比较严重。而经过绞股蓝皂苷的处理后，显著降低了T2DM小鼠血清中AST和ALT的浓度。

观察经H&E染色后的小鼠肝脏的病理学变化（图4C），NC组肝细胞显示沿中心静脉放射状整齐排列、结构清晰，无异常改变。相比之下，DM组肝细胞显示排列不整齐、明显肿胀，表明具有广泛的肝损伤。用Gp-I和Gp-II处理后，水肿较少，结构基本恢复正常，改善效果与MH组相似。检测结果与通过血清指标得的结果一致。结果表明绞股蓝皂苷的干预可以保护肝脏，使得T2DM小鼠在一定程度上免受高血糖和IR引起的损害。

图4 (A) 肝糖原含量。(B) 血清AST、ALT浓度。(C) 各组肝脏组织病理学改变，H&E评价肝脏肥厚，标度为50 μm

实验小鼠肝脏组织AMPK和p-AMPK蛋白表达量分析

与DM组相比，MH组p-AMPK的含量能够显著的増加（P < 0.05）；T2DM小鼠在剂量50 mg/kg两种绞股蓝皂苷的干预下，同样，能够增加p-AMPK表达（P< 0.05），分别升高了13.0%和15.1%。从AMPK/p-AMPK结果来看，T2DM小鼠肝组织内AMPK磷酸化程度明显降低，说明糖尿病发病时，肝脏组织降血糖功能性受到抑制，两种皂苷能够使AMPK磷酸化增加，激活AMPK。实验证明，两种皂苷可在动物体内使AMPK磷酸化，激活AMPK，进而影响血糖代谢。与NC组相比，DM组PC蛋白表达量显著升高（P < 0.05），表明糖尿病小鼠的糖异生效率增高。与DM组相比，两种皂苷样品组PC表达量低于DM组，但与DM组无明显差异（P > 0.05）。DM组的PEPCK表达较NC组显著增加（P < 0.01），T2DM小鼠PEPCK关键酶活增高。T2DM小鼠在剂量50 mg/kg两种绞股蓝皂苷的干预下，同样，均能使PEPCK蛋白的含量显著降低（P < 0.05）。实验证明，可通过激活AMPK，从而抑制PEPCK含量，进而减缓糖异生代谢效率，最终抑制葡萄糖产生。与NC组相比，DM组G6Pase的含量显著升高（P < 0.01）；T2DM小鼠在剂量50 mg/kg两种绞股蓝皂苷的干预处理下，同样，均能使G6Pase蛋白的含量显著降低（P < 0.05）。实验证明，可通过激活AMPK，从而抑制G6Pase含量，进而减缓糖异生代谢效率，最终抑制葡萄糖产生。

图5 绞股蓝皂苷对小鼠肝脏中AMPK和p-AMPK的影响

Conclusion

在本研究中，作者发现Gp-I和Gp-II可以改善stz诱导的T2DM小鼠的胰岛素抵抗和高血糖，这可能是通过AMPK介导的信号通路实现的。综上所述，作者的研究为绞股蓝皂苷作为潜在的抗糖尿病功能因子的开发提供了契机。

第一作者简介

宋梦雪，女，沈阳农业大学食品学院2018级硕士研究生。主要研究方向为功能性食品及其评价，参与国家自然科学基金及辽宁省自然科学基金的相关工作。

通信作者简介

史琳，女，沈阳农业大学食品学院副教授，硕士生导师。台湾中正大学博士后，原沈阳军区总医院博士后。兼任中国中医药信息学会食疗分会理事、沈阳市营养学会理事、辽宁省绿色经济发展研究会药食同源养生分会理事。辽宁省“百千万人才工程”万人层次、沈阳市拔尖人才、沈阳农业大学天柱山青年骨干教师。研究领域为功能食品及天然产物活性成分研发，近年来一直致力于人参皂苷的开发与利用，对绞股蓝、人参、西洋参、珠子参等植物中皂苷成分的结构、体内外降脂、降糖、抗肿瘤等活性的作用机制进行了系统研究。近五年主持国家自然科学基金青年项目1项、中国博士科学基金后面上项目1项、辽宁省科技厅面上项目1项、企业委托项目2项。获中国食品工业协会科学技术特等奖、辽宁省自然科学学术成果二等奖、沈阳市自然科学学术成果三等奖等。在国际期刊Journal of Functional Foods、Chemico-Biological Interactions、Chinese Chemical Letters、Helvetica Chimica Acta、Natural Product Research、Journal of Asian Natural Products Research及《中草药》、Chinese Herbal Medicines等杂志以第一作者或通讯作者发表学术论文22篇，授权发明专利1项，参编教材2部。

Gypenoside ameliorates insulin resistance and hyperglycemia via the AMPK-mediated signaling pathways in the liver of type 2 diabetes mellitus mice

Mengxue Songa, Dehong Tana,b, Bin Lia,b, Yanqun Wanga,b, Lin Shia,b,*

aCollege of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

bKey Laboratory of Healthy Food Nutrition and Innovative Manufacturing of Liaoning Province, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China

*Corresponding authors:

E-mail: shilin@syau.edu.cn

Abstract

Gynostemma pentaphyllum, also called “Southern Ginseng” in China, is a traditional Asian folk medicinal plant. Gypenosides (Gps) are the biologically active constituents of G. pentaphyllum, which have been reported with hypoglycemic activity. However, the underlying mechanisms are unclear. The effects of two Gps (Gp-I and Gp-II) on type 2 diabetic mellitus (T2DM) mice, induced by high-fat and high-sugar diet and streptozotocin, were evaluated to explore the mechanism of their hypoglycemic actions. Gps reduced fasting blood glucose and serum lipids, as well as significantly improved T2DM mice glucose tolerance and insulin resistance (IR). After Gps treatment, the severity of liver injury was reduced and liver glycogen content increased. In addition, Gps promoted the phosphorylation of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), and downregulated the key proteins phosphoenolpyruvate carboxy kinase and glucose-6 phosphatase, in the AMPK signaling pathway. Thus, our study suggests that Gps mediate hepatic gluconeogenesis and improve IR via activating AMPK signaling pathway in T2DM mice.

Reference:

SONG M X, TAN D H, LI B, et al. Gypenoside ameliorates insulin resistance and hyperglycemia via the AMPK-mediated signaling pathways in the liver of type 2 diabetes mellitus mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(5): 1347-1354. DOI:10.1016/j.fshw.2022.04.029.

文章编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意

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