【合成】通过DOE抑制 SPPS 中同时 Fmoc-His(Trt)-OH 消旋和 Nα-DIC 封端

摘要

在固相多肽合成中偶联 Fmoc-His(Trt)-OH 经常伴随着明显的外消旋化。组氨酸是在肽合成中倾向于外消旋的最敏感的氨基酸残基之一。在本研究中，利用色谱纯化不能有效清除D-His外消旋杂质。因此，DOE被使用以降低该His外消旋 。导出的 DOE 模型揭示了 Fmoc-His(Trt)-OH 的预活化对其外消旋产生重要影响。强化 Fmoc-His(Trt)-OH 预活化会激化这种副反应。另一方面，没有氨基酸预活化，采用 in situ Fmoc-Xaa-OH活化，另一个副反应，即N，N二异丙基碳二亚胺封端(Nα-DIC-封端)被提升。组氨酸消旋化和多肽 Nα 封端之间存在矛盾关系通过 DOE 调查发现。建立了组氨酸消旋和多肽Nα-DICF封端的重要模型在此基础上完成封端和调和以平衡这两种副反应。

介绍

Fmoc-His(Trt)-OH 是最容易外消旋的多肽合成中的氨基酸。如此高的不稳定性是主要归因于其侧链不受保护的咪唑基Nπ可以在分子内 进攻Hα ，而后者的酸度会随着 Fmoc-His(Trt)-OH的活化而增强。所得碳负离子的再质子化导致 His-Cα 消旋化（Scheme 1）。

Scheme 1. Fmoc-His(Trt)-OH 活化和由 His-Nτ 引导的偶联过程中组氨酸的消旋化。

总的来说，在 多肽固相合成(SPPS) 中可实施两种氨基酸活化策略，即原位 in situ活化和预活化。在原位活化策略中，将 Fmoc-Xaa-OH 和偶联剂依次添加到底物肽树脂中，而无需预先混合。Fmoc-Xaa-OH在偶联试剂存在下 与肽-Nα 的偶联以一锅法发生。因此，在原位活化策略中，活化的 Fmoc-Xaa-OH 的存在期被最小化。反之，当采用预活化策略时，Fmoc-Xaa-OH 和偶联剂在偶联反应之前混合。预活化过程通常需要几分钟才能将 Fmoc-Xaa-OH 转化为其相应的活化物质。当预活化到期时，将活化的 Fmoc-Xaa-OH 添加到肽树脂中以启动目标偶联反应。

尽管原位活化策略可以有效缩短活化的 Fmoc-Xaa-OH 物种的存在期，这可能有助于缓解氨基酸外消旋化，但预活化策略仍被工业界广泛采用。这是考虑到偶联试剂和肽-Nα 部分之间的副反应导致的肽链终止，uronium和碳二亚胺偶联剂可以将伯氨基和仲氨基转化为相应的胍物质（Scheme 2）。

Scheme 2. DIC 介导的 Fmoc-Xaa-OH 活化/偶联和封端终止肽链副反应

结果与讨论

结果与讨论

在该研究项目中，一个Fmoc-His(Trt)-OH 缩合反应所导致的消旋化副反应被以DOE的方式进行研究优化。DIC/HOBt被用作缩合试剂和缩合添加剂。已知氨基酸预活化温度、时间和偶联反应温度对于氨基酸偶联的各种特征杂质的形成具有潜在的关键性。在全因子DOE (full factorial design)设计中，三个研究参数的范围，即耦合温度、预活化温度和预活化时间，指定为[10°C，30°C]，[10°C，30 °C] 和 [1 分钟，20 分钟]。总共实施了 11 次实验，包括整个设计空间的三个中心点复制，以测试曲率并估计纯误差。设计的响应包括 D-His(Trt) 和 DIC-封端 杂质。11个DOE实验结果在Table 1中显示。

Table 1. DIC/HOBt·H2O 的 Fmoc-His(Trt)-OH 耦合的 DOE实验结果

D-His 模型

D-His 模型（Figure 1）显示，预活化时间和预活化温度在 Fmoc-His(Trt)-OH 消旋化中起最重要的作用。此外，预活化温度和预活化时间之间的相互作用强烈影响 D-His 杂质含量。其他重要因素，即耦合温度以及耦合温度和预活化时间之间的相互作用，影响相对较小。这些发现在机制上是合理的，因为氨基酸的外消旋化主要发生在其羧酸盐被活化时。氨基酸被预活化的程度越强，例如在高温下和预活化时间延长，其外消旋作用就越大。

Figure 1. D-His 杂质与预活化温度/预活化时间的 3D 表面图（耦合温度恒定为 20 °C）。

鉴于预活化时间的突出关键性，需要将此参数控制在低水平，以确保 D-His 杂质低于目标含量 2.0%。一旦预活化时间为一分钟，预测的 D-His 杂质含量将在设计空间内一致小于 2.0%。如果预活化温度和偶联温度都设置在低水平，它甚至可以降低到 1.0% 以下。如果将预活化时间延长至十分钟，则组氨酸外消旋化保持在2.0%以下的概率将大大降低，而当预活化超过二十分钟时，这一目标几乎无法实现（Figure 2）。

Figure 2. D-His 杂质与耦合温度/预活化温度的 3D 表面和等高线图，预活化时间为常数（从左到右分别为 1、10、20 分钟）。

DIC-封端 模型

DIC-封端模型表明，预活化时间是DIC 封端副反应的最关键参数，其次是耦合温度。与 D-His 模型相反，预活化温度和预活化时间对 DIC 封端的主要影响为负，表明通过单独增加预活化温度或预活化时间 的方法，DIC-封端杂质会减少（Figure 3）。

Figure 3. DIC 封端杂质与预活化温度/预活化时间的 3D 表面图（耦合温度恒定为 20 °C）。

总结

Fmoc-His(Trt)-OH在偶联反应过程中高度倾向于消旋化。本研究中的 D-His 肽杂质对纯化过程提出了明显的挑战。通过DIC/HOBt·H2O/DMF耦合方法三因子两水平全因子DOE设计，对 Fmoc-His(Trt)-OH 偶联进行了优化，以将外消旋化降低到 2.0%。所有三个研究的参数，即耦合温度、预活化温度和预活化时间，在D-His以及DIC-封端的两个模型中都很重要，并且预活化时间在这两种情况下都是最显著的因素。双因素相互作用（耦合温度*预活化时间）和（预活化温度*预活化时间）对 D-His 模型是显著的，而（耦合温度*预活化温度）对于 DIC 封端模型是显著的。预活化时间/预活化温度与 D-His/DIC 封端之间的相关性是相反的。更长的预活化时间和预活化温度将减弱 DIC 封端，但会加剧组氨酸外消旋化。

鉴于在本研究中 D-His 抑制比 DIC 封端具有更高的优先级，因此设置了有利于 D-His 最小化的工艺参数。轮廓图叠加方法被操纵以针对能够同时满足 D-His (≤2.0%) 和 DIC 封端 (≤0.2%) 目标的参数设置。

具体来说，本研究最突出的发现总结如下：

• 组氨酸消旋取决于偶联剂/添加剂和活化策略。

• 高温和长时间的强化预活化会加剧组氨酸外消旋化。

• DIC 封端伴随氨基酸偶联过程中的氨基酸外消旋。

• 通过提高预活化温度和延长预活化时间进行充分的氨基活化可以减少 DIC 封端和其他相关副反应。

文献详情：

Yi Yang*, Lena Hansen, Alberto Baldi. Suppression of Simultaneous Fmoc-His(Trt)-OH Racemization and Nα-DIC-Endcapping in Solid-Phase Peptide Synthesis through Design of Experiments and Its Implication for an Amino Acid Activation Strategy in Peptide Synthesis. Organic Process Research & Development. 2022. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.2c00144