《食品科学》：源于Bacillus megaterium STB10的直链麦芽五糖生成酶酶学性质及其产物合成规律

直链麦芽低聚糖（MOS）是由3～10 个葡萄糖（G1）单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的链状低聚糖。其中，直链麦芽五糖（G5）由于其具有良好的加工适应性、较好的溶解度、适宜的甜度、较强的抗结晶性能及抑制淀粉回生能力等特性受到食品领域研究者的广泛关注。

G5 的酶法生产主要利用直链麦芽五糖生成酶（MFA）作用于淀粉的α-1,4-糖苷键，生成以G5为主的MOS混合物，并在此基础上实现G5的分离与纯化。目前，MFA在细菌、嗜温和嗜热真菌中均有发现，其中，以在芽孢杆菌属中发现的MFA为主。江南大学食品学院的韩 煦、班宵逢、李兆丰*等筛选来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）STB10的mfa（Bm-mfa）基因，前期研究显示其可能具有较高的产物特异性，构建该基因的枯草芽孢杆菌表达系统，实现BmMFA的胞外表达，并对其酶学性质及产物合成规律进行研究，以期为G5的酶法制备提供理论依据。

1、BmMFA的表达、分离和纯化

将基因工程菌枯草芽孢杆菌WB600（pST/Bm-mfa）接种到TB发酵培养基中，于25 ℃培养60 h后，离心收集发酵上清液，测定其催化活力可达到196.57 U/mL，比活力达到588.54 U/mg，发酵上清液中蛋白含量为76.98 mg，表明BmMFA在枯草芽孢杆菌中成功进行了分泌表达，且发酵水平较高。采用疏水柱和强阴离子交换柱对粗酶液进行分离纯化，图1为BmMFA的SDS-PAGE验证结果，经两步纯化的目的条带相对分子质量大小与酶的理论分子质量（56 kDa）符合。BmMFA与其他来源的MFA氨基酸序列比对结果如图2所示。

2、BmMFA的酶学性质分析

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最适反应温度及热稳定性

图3a结果表明，在不同的温度下，BmMFA催化活力呈现先上升后下降的趋势。在50 ℃时，BmMFA的催化活力达到最大值。酶的催化活力与反应温度密切相关，温度对酶的催化特性的影响主要体现在两方面：一方面可归属于热力学的正效应，当反应温度逐渐升高时，酶的催化位点逐步暴露，单位时间内酶与底物结合几率增大，酶的催化效率上升；随着温度的进一步提升，酶失活的负效应增强，底物对酶的保护作用不足以抵抗热变性作用，导致酶发生解折叠作用，表现为其催化活力的降低。50 ℃为该酶的正负效应达到平衡的温度，即该酶在50 ℃时具有最高的催化活力。

此外，还对BmMFA的热稳定性进行了研究，结果见图3b。随着温度的上升，BmMFA的热稳定性呈现下降的趋势，在酶的最适温度50 ℃时，该酶的半衰期约为30 min，与其他来源的MFA相比，其热稳定性还有待进一步提升。因此，在工业上应用BmMFA时，反应温度不宜过高。

02

最适反应pH值及pH值稳定性

图4a结果表明，在不同pH值下，BmMFA的催化活力和稳定性呈现先上升后下降的趋势，BmMFA的最适反应pH值为7.0。此外，研究还发现，相同pH值下，BmMFA在甘氨酸-NaOH缓冲液中的催化活力高于NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 缓冲液。这可能是由于甘氨酸-NaOH缓冲液中的甘氨酸增强了酶与底物的亲和力，并对酶分子构象具有一定的保护作用。

图4b结果显示，在pH 6～10下，BmMFA仍可保持超过80%的催化活力，表明其可适应较宽的pH值范围，且该酶对碱性环境的耐受性强于酸性环境的耐受性。在pH 7.0时，该酶可保持最高程度的稳定性，因此在工业上应用BmMFA时，适宜在pH值为中性的反应体系环境中。

03

金属离子对酶活力和热稳定性的影响

如图5所示，相比较于未添加金属离子的对照组，Fe 3＋ 、Mn 2＋ 、Cu 2＋ 、Zn 2＋ 显著降低了BmMFA的催化活力（P＜0.05），表明BmMFA对重金属离子较敏感。添加其他金属离子时，BmMFA的催化活力可保持在80%以上，这表明BmMFA具有相对较强的离子耐受性。不仅如此，少量Ca 2＋ 还具有激活BmMFA的作用，表现为Ca 2＋ 提升了BmMFA的催化活力。

此外，实验还研究了Ca 2＋ 、Mg 2＋ 、Na ＋ 对BmMFA热稳定性的影响，结果如图6所示。以未添加金属离子的酶为空白对照，0.5 mmol/L Ca 2＋ 使BmMFA在55 ℃的半衰期由13 min提高到15 min，而Mg 2＋ 、Na ＋ 则降低了BmMFA的热稳定性。说明在实际生产MOS时，可以适当添加Ca 2＋ 以保证BmMFA的应用效果。

04

BmMFA的动力学分析

结果如表1所示。动力学参数Km及Kcat/Km分别代表酶对底物的亲和力及催化效率。结果显示，以支链淀粉为底物时，BmMFA的Km值远小于以直链淀粉为底物，说明BmMFA对支链淀粉的亲和力显著高于直链淀粉（P＜0.05）。此外，以支链淀粉为底物时，BmMFA的Kcat/Km值比以直链淀粉为底物时大，表明该酶对支链淀粉的催化效率更高。因此，在工业上应用BmMFA时，适宜选择支链淀粉含量相对较高的底物。

05

BmMFA催化反应模式分析

为确定BmMFA的反应模式，将α-淀粉酶、β-淀粉酶和BmMFA各自水解淀粉过程中的还原糖含量变化（以葡萄糖计）和淀粉链聚合度（碘蓝值）变化之间的关系用图7a（支链淀粉为底物）和图7b（直链淀粉为底物）表示。结果显示，BmMFA水解支/直链淀粉的碘蓝值-还原糖含量趋势更接近于α-淀粉酶，这表明BmMFA水解淀粉时体现出内切酶的作用机制。

3、BmMFA的产物合成规律

01

BmMFA的产物特异性

结果见表2。麦芽糊精经BmMFA充分作用后，其酶解产物为不同聚合度的MOS混合物，其中，G1～G7为BmMFA的主要产物；在G1～G7中，G5的占比最高，可达到42.08%，且与其他聚合度的MOS副产物相比，具有显著差异（P＜0.05）。BmMFA水解麦芽糊精24 h后，底物转化率达到76.61%，G5得率可以达到32.24%，与其他来源MFA相比，BmMFA具有较高的产G5的能力，表现出相对较强的G5产物特异性，适宜工业上酶法生产G5。

02

底物结构对产物组成的影响

在相同加酶量及反应条件下，用BmMFA分别水解支/直链淀粉，其所得产物所占比例见图8。两组底物水解产物中G1～G5含量均随反应时间的延长逐渐增加。在相同反应时间下，相比于直链淀粉，以支链淀粉为底物时BmMFA酶解产物中G5含量更高，以支链淀粉为底物时，BmMFA表现出更好的产物特异性。

03

底物结构对反应程度的影响

MFA对反应程度及底物水解程度的高低对生产成本具有重要意义，以酶对底物的转化率为指标，探究底物结构对酶水解反应程度的影响，结果见图8。反应2 h，BmMFA对支链淀粉的转化率为24.15%，是以直链淀粉为底物时转化率的2.13 倍。这可能是因为在反应初期，支链淀粉的簇状结构有利于酶与底物的结合。

反应进行到中后期（12～24 h），BmMFA水解支链淀粉的转化率增速不及以直链淀粉为底物，这可能是由于随着淀粉水解程度的增加，以支链淀粉为底物可能产生较多的极限糊精，BmMFA难以继续作用于这些极限糊精，使得底物转化率增速减慢。

结论

本研究实现了BmMFA在枯草芽孢杆菌表达系统中的分泌表达，并对其酶学性质和产物合成规律进行了研究。结果显示，BmMFA的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH值为7.0，其具有相对较宽的pH值应用范围；BmMFA倾向于内切酶的作用机制，以支链淀粉为底物时的亲和力及催化效率较高；产物合成规律研究结果表明BmMFA具有较好的产物特异性，水解麦芽糊精24 h后产物中G5质量分数在42%以上，表现出了相对较强的工业化生产G5的应用潜力；底物为支链淀粉时更利于主产物G5的累积及酶对底物的水解程度。BmMFA酶学性质及产物合成规律的研究，为酶法制备G5的工业化应用提供了理论依据。

通信作者简介

李兆丰，男，1979年9月出生，湖南安化人，中共党员，教授，博士生导师，国家自然科学基金优秀青年基金项目和霍英东基金会青年教师基金项目获得者。现任江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心常务副主任，兼任中国粮油学会玉米深加工分会秘书长、江苏省粮油学会副理事长。入选江苏特聘教授、江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人培养对象、无锡市优秀教育工作者、无锡市有突出贡献中青年专家和江苏省“双创博士”资助对象。

长期从事淀粉生物技术领域研究，特别在淀粉酶异源表达、结构解析、催化机制、分子改造、产物合成以及米面制品的开发与应用方面研究深入，围绕如何突破天然来源菌自身调控提高淀粉酶的产量、如何优化淀粉酶的使用性能以适应工业化应用、如何提升淀粉衍生物的制备效率以降低其生产成本等一系列关键科学问题，已取得系列创新型研究成果。近5年来，作为项目负责人，主持了“十三五”国家重点研发计划课题、国家自然科学基金等国家和省部级科研项目8项；发表第一/通讯作者SCI论文46篇，其中32篇发表在Biotech. Adv.、Trends Food Sci. Tech.、Crit. Rev. Biotechnol.、J. Agr. Food Chem.、Food Chem.、Food Hydrocolloid.等食品和生物技术领域的中科院1区期刊上；出版著作4部：《未来食品科学与技术》(2021)、《Physical Modifications of Starch》(2018)、《酶工程》(2013)、《环糊精葡萄糖基转移酶的制备及应用》(2011)，其中《酶工程》为科学出版社生物工程类案例版教材；申请国家发明专利70余项（含国际6项），已授权国家发明专利51项（含国际1项）；完成核心技术转化10余项；获国家技术发明奖二等奖、教育部技术发明奖一等奖、中国粮油学会青年科技奖等科技奖励。

第一作者简介

韩煦，江南大学食品科学与工程学院硕士研究生。研究生阶段主要进行淀粉生物技术方面的研究，课题方向为直链麦芽五糖酶的异源表达及产物特异性研究，涉及淀粉酶异源表达、催化机制、分子改造、产物合成方面，围绕准确有效的淀粉酶性能优化、高产高效的淀粉酶分泌表达、定向可控的产物合成等方向，解决淀粉酶使用性能差、生产效率低及产物得率低问题。以第一作者在食品和生物技术领域期刊Food Research International (JCR分区：Q1)发表SCI论文1篇；申请1项国家发明专利已获受理。

本文《源于Bacillus megaterium STB10的直链麦芽五糖生成酶酶学性质及其产物合成规律》来源于《食品科学》2022年43卷10期73-80页，作者：韩煦，班宵逢，李才明，顾正彪，李兆丰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210604-049。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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